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目的:为了探讨具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)通过上调TLR4的表达,对PAK1、PAK1(Thr423)、beta-catenin、beta-catenin(Thr675)、Cyclin-D1、C-myc等基因蛋白水平表达的影响,由此推测具核梭杆菌在结直肠癌变过程中所扮演的角色。 方法:将结直肠癌(CRC),无蒂锯齿状腺瘤(SSA),增生性息肉(HP),传统腺瘤(TA),结直肠癌相应淋巴结标本的石蜡切片用免疫组化方法检测各组织中PAK1和TLR4的阳性表达情况,原位杂交方法检测不同组织中具核梭杆菌的存在及定位情况;提取由临床收集的结直肠癌(CRC)标本中分离培养所得的具核梭杆菌LPS,将其作用于结直肠癌细胞株SW480,同时用商品化LPS以相同条件作用SW480细胞,利用Western blot对比分析具核梭杆菌对细胞内TLR4、PAK1、PAK1(Thr423)、beta-catenin、beta-catenin(Thr675)、Cyclin-D1、C-myc等基因蛋白水平表达的影响。为进一步证实细胞内蛋白之间的相互影响,利用TLR4特异性拮抗剂TAK-242和PAK1特异性拮抗剂IPA-3作用SW480细胞,利用Western blot观察当细胞内TLR4、PAK1作用被拮抗后,下游相应蛋白的表达变化。利用细胞免疫荧光,观察 LPS、TAK-242、IPA-3作用细胞后,beta-catenin(Thr675)在细胞内的表达及定位的变化。 结果: (1)免疫组化结果显示:PAK1、TLR4、beta-catenin在 CRC组织中的表达明显高于其他组织类型,且 CRC组织中科观察到beta-catenin明显的核聚集现象; (2)荧光原位杂交结果显示:近端CRCs中Fn阳性率为89.6%,近端HPs中Fn阳性率为65.7%,SSAs中Fn阳性率为78.8%,近端TAs中Fn阳性率为28.9%,远端CRCs中Fn阳性率为42.2%,远端HPs中Fn阳性率为47.5%,远端TAs中Fn阳性率为24.4%,转移淋巴结中Fn阳性率为100%,无转移淋巴结中Fn阳性率为40%;Fn普遍存在于近端SP中,TA中少见,近端CRCs和转移淋巴结中Fn较远端CRCs和无转移淋巴结中Fn阳性率高; (3)Western blot结果显示,Fn LPS和商品化LPS对SW480细胞内蛋白表达有类似作用。随着两种LPS作用时间延长(0,2,6,12,24h),TLR4、PAK1(Thr423)、beta-catenin(Thr675)、Cyclin-D1、C-myc的表达呈递增趋势,此趋势在Fn LPS作用细胞中更为明显;以TAK-242作用SW480细胞,随着作用时间延长(0,2,6,12,24h),PAK1(Thr423)、beta-catenin(Thr675)、Cyclin-D1的表达呈递减趋势;以IPA-3作用于SW480细胞,随着作用时间延长(0,2,6,12,24h),PAK1(Thr423)、beta-catenin(Thr675)、Cyclin-D1的表达呈递减趋势,TLR4呈递增趋势。Fn通过其LPS增加TLR4的表达,进而提高PAK1 S423、beta-catenin S675的磷酸化程度,以此激活Wnt信号通路,促进结直肠癌的发生发展。 (4)Fn LPS、TAK-242、IPA-3组合作用于SW480细胞,利用细胞免疫荧光可观察到,TAK-242、IPA-3预处理细胞,即使后来加入LPS,其beta-catenin(Thr675)的表达较对照组未预处理只添加LPS细胞中beta-catenin(Thr675)的表达量低,对照组细胞中可观察到beta-catenin(Thr675)明显核聚集现象。 结论:具核梭杆菌通过增加细胞中TLR4的表达量,直接或间接增加beta-catenin(Thr675)的磷酸化,从而促进结直肠肿瘤的发生发展。