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在兽医学领域内毒素血症主要继发于动物子宫蓄脓、脓皮症及严重外科感染等过程中。内毒素血症常导致海马损伤,其临床发病率约为70%,能够引起脑萎缩,认知障碍甚至导致死亡。海马组织损伤后,病患常预后不良且病死率极高。但到目前为止内毒素血症致海马损伤的发生、发展的分子机制尚不清楚,导致临床上缺乏相应诊治方案及有效治疗药物,因此探究内毒素血症致海马损伤的发病机制已经成为兽医临床的热点及难点。本试验通过建立内毒素血症模型,从组织水平、细胞水平及分子水平三个层次探究LPS致海马损伤的发生发展机制。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对PC12细胞进行基因编辑,从而验证c-Myc/CLIC4通路在LPS诱导PC12细胞凋亡中的作用机制。为LPS致海马损伤的发病机制提供新思路,并为今后临床开展内毒素血症致海马损伤的治疗及进行相关的机制研究提供理论依据及试验基础。在体试验选取36只健康雄性SD大鼠,随机均分为CON组和LPS组。LPS组腹腔注射1 mL/kg LPS(10 mg/mL),CON组腹腔注射1 mL/kg生理盐水。造模4 h后经心脏采血并处死大鼠,开颅,分离大脑皮层后取海马备用。通过检测大鼠血清中相关炎症指标,观察海马组织病理学变化,观察海马超微组织结构变化,检测线粒体途径凋亡相关蛋白表达量,以及检测c-Myc/CLIC4通路的mRNA水平及蛋白表达量,阐明线粒体凋亡途径在LPS致海马损伤中的致病机制,并探究c-Myc/CLIC4通路是否参与对线粒体凋亡途径的调控。体外试验中,选用PC12细胞,分成5组,分别为CON组,LPS组,sgc-Myc组,sgCLIC4组,sgCON组。sgc-Myc组,sgCLIC4组细胞分别用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑c-Myc基因、CLIC4基因。并做如下处理:CON组更换新完全培养基;其他各组更换含200μg/mL LPS的完全培养基。应用流式细胞术,Annexin V-FITC及Western blot等方法检测敲除c-Myc及CLIC4基因后细胞凋亡水平的变化,从而证实c-Myc/CLIC4通路对线粒体凋亡途径的调控作用。炎症因子检测结果表明,与CON组相比,LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-18的水平显著升高(p<0.01),证明内毒素血症模型建立成功。组织病理学结果显示,CON组大鼠海马神经元排列紧密,细胞结构完整。LPS组海马神经元数量明显减少,大量神经元皱缩,胞体变小,核仁消失,细胞间间隙增加。海马超微结构观察结果显示,CON组细胞核核膜清晰,线粒体结构完整,LPS组细胞核体积缩小,核膜完整性破坏,线粒体肿胀,线粒体嵴断裂,且Western blot结果显示,LPS组cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Cyt C和Bax/Bcl-2表达量显著上升(p<0.01),这表明线粒体凋亡途径的激活是LPS致海马损伤的主要发病机制之一。实时荧光定量PCR及Western blot结果显示,LPS组c-Myc及CLIC4 mRNA的水平及蛋白表达量明显升高(p<0.01),而p53的mRNA水平及蛋白表达量与CON组相比无明显变化(p>0.05),证明线粒体凋亡途径的激活与c-Myc/CLIC4通路有关。体外试验中,流式细胞术及Annexin V-FITC结果显示与CON组相比,LPS组及sgCON组细胞凋亡率明显升高(p<0.01),而sgc-Myc组及sgCLIC4组细胞凋亡率无明显变化(p>0.05)。Western blot结果显示,与CON组相比,LPS组及sgCON组cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Cyt C、Bax/Bcl-2表达量显著上升(p<0.01),而sgc-Myc组及sgCLIC4组线粒体凋亡途径相关蛋白表达量与CON组比无明显差异(p>0.05)。且Western blot结果表明,敲除cMyc后,CLIC4蛋白水平显著下降,而敲除CLIC4后,c-Myc水平无明显变化,表明c-Myc作为CLIC4上游调控因子,激活线粒体凋亡途径进而介导海马神经元损伤。在体试验结果证实,LPS致海马损伤时神经元凋亡水平的升高,与c-Myc/CLIC4通路激活线粒体凋亡途径有关。体外试验证实,c-Myc/CLIC4通路的激活是LPS诱导神经元凋亡的重要因素,并且证实c-Myc作为CLIC4的上游调控因子,在LPS致海马损伤的发生发展过程中发挥着重要作用。综合本试验结果提示c-Myc/CLIC4通路可能是临床上防治内毒素致海马损伤的关键靶点。