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本研究通过比较Tremor大鼠和正常Wistar大鼠海马中线粒体形态结构的改变、线粒体琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)以及对Na+-K+-ATP酶活性的变化以及细胞色素c(cytochrome c,Cytc)的表达,探讨线粒体与遗传性癫痫的关系。
材料与方法:
1、动物、试剂与仪器.
Tremor大鼠和正常Wistar大鼠13-15周龄,雌、雄不限,在标准条件下饲养(12小时交替照明,湿度为50％～70％,24℃),动物自由进食饮水,每组6只。线粒体提取试剂盒(普利莱基因技术有限公司),琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒(南京建成),ATP酶测试盒(南京建成),羊抗兔cytochrome c多克隆抗体(美国santa公司)。Bradford法测定蛋白浓度试剂盒(普利莱基因技术有限公司)彩色预染蛋白质分子量标准(碧云天生物技术公司)。DYY-5型稳流稳压电泳仪电泳仪(北京六一仪器),Hoefer miniVE垂直电泳,凝胶成像系统(LWP,USA)低温高速离心机(Centdfuge5810R,德国Eppendorf)等。
2、超薄切片透射电镜观察对比Tremor大鼠与Wistar大鼠海马线粒体形态结构变化.
Tremor大鼠及Wistar大鼠经乙醚麻醉,断头,低温下进行脑海马剥离,取海马组织约1mm3、2.5％戊二醛固定,脱水,浸透,包埋,切片,染色,观察。
3、检测琥珀酸脱氢酶(SDH)与Na+-K+-ATP酶的活性.
提取Tremor和Wistar大鼠脑海马组织线粒体,根据试剂盒说明,使用分光光度计检测琥珀酸脱氢酶(SDH)与Na+-K+-ATP酶的活性。
4、Western blotting方法检测Cytc蛋白表达.
提取Tremor和Wistar大鼠脑海马组织线粒体蛋白,考马斯亮蓝法蛋白定量,经12％SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转印至PVDF膜上,一、二抗孵育,ECL化学发光法显色。
5、统计学分析.
使用SPSS13.0软件对结果进行分析,各组结果以平均数士标准差表示,两组间比较用t检验。
实验结果:
1、透射电镜结果显示:Tremor大鼠脑海马组织中线粒体与Wistar大鼠脑海马组织中线粒体相比,有不同程度的水肿,断裂,固缩以及空泡化。
2、酶活力检测结果显示:Tremor大鼠脑海马组织中琥珀酸脱氢酶(SDH)与Na+-K+-ATP酶与正常Wistar大鼠相比均显著下降(P＜0.01)。
3、Western blotting结果显示:Tremor大鼠脑海马线粒体中Cytc蛋白的表达与正常Wistar大鼠相比显著降低(P＜0.05)。
结论:
Tremor大鼠脑海马组织中线粒体形态结构相对Wistar大鼠有不同程度的损伤,线粒体中的重要标志酶——琥珀酸脱氢酶(SDH)与Na+-K+-ATP酶的活力显著下降,细胞色素c蛋白的表达降低,这些结果表明线粒体对癫痫十分敏感,在遗传性癫痫中线粒体出现了结构和功能的损伤。线粒体与癫痫之间结构和功能上的联系为减轻癫痫后脑损伤和神经保护的发展提供了新的展望。