北极海洋红球菌Rhodococcus sp.B7740产稀有类胡萝卜素和异戊二烯醌类物质的鉴定、纯化

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北极海洋红球菌Rhodococcus sp.B7740(Rh sp.B7740)是我国北极科考队第三次科考期间于北极站点B77处(1464?9.28?W,76?58.08?N)25米深的海水中获得的菌株,经16S r RNA序列分析和形态学观察确定其为红球菌。其外观呈现鲜艳的橙红色,生存环境极为特殊,在此之前尚未见相关次生代谢产物的报道。为了探索和了解这株北极海洋红球菌所产红色色素的特殊结构及功能性,我们采用非常规的分离纯化方法,采用多光谱和LS-MS/MS分析,发现和确证了所产色素为类胡萝卜素及类异戊二烯醌类的混合物(B7CIQE),有别于其他来源的类胡萝卜素,其中包含特殊结构的芳香类胡萝卜素isorenieratene,chlorobactene和synechoxanthin,它们首次在红球菌中被鉴定,自然界中也十分稀有和新奇。除此而外,价格昂贵且稀有的长链质子化甲基萘醌MK8(H2)以高产量存在(约1mg/g细菌湿重),也为我们研究有价值的异戊二烯类化合物提供了物质基础。为了证实北极海洋红球菌Rhodococcus sp.B7740中异戊二烯类色素的健康意义,首先对其基本生物活性进行了研究。然后在此基础上,采用本课题研究得到的高速逆流色谱(HSCCC)体系首次同时分离获得了高纯度的芳香类胡萝卜素的3种单体;采用多光谱和生物技术着重研究了食品中存在,但研究极少的isorenieratene(φ,φ-胡萝卜素)的稀有生物活性,并进行了较为系统的评价。课题的研究不仅为探索北极海洋新奇微生物中有益于人类的色素资源宝库展示了新的研究领域,丰富了海洋微生物类胡萝卜素的多样性,同时也为揭示这些罕见的芳香类胡萝卜素的结构和独特生物活性奠定了理论和实验基础。本论文的主要研究结果如下:1. B7CIQE主要组成成分研究采用溶菌酶破壁和表面活性剂增溶,成功地从北极海洋红球菌Rhodococcus sp.B7740中同时提取出了类胡萝卜素和类异戊二烯醌类化合物,经HPLC-DAD-MS/MS联用,初步探究了B7CIQE的主要成分,证实该菌中含有9种类胡萝卜素和14种异戊二烯醌,发现和首次从红球菌鉴定了三种罕见的芳香类胡萝卜素,包括18%all-trans-synechoxanthin(24.18-33.40μg/g),11%chlrobactene(14.78-19.34μg/g),9%isorenieratene(12.09-15.82μg/g),在此之前未见任何相关文献报道,为北极海洋红球菌提供了新的研究方向和领域,也丰富了极地海洋微生物来源类胡萝卜素的多样性和新颖性,同时也获得了新颖芳香类胡萝卜素的新资源,使Rh sp.B7740成为了一种极具潜力的工程菌。2. B7CIQE抗氧化与抗增殖活性研究采用β-胡萝卜素漂白法等方法,在体外和细胞水平研究了Rhodococcus sp.B7740红球菌中类胡萝卜素及类异戊二烯醌类提取物整体的抗氧化及抗人肝癌细胞Hep G2和人口腔癌细胞KB的增殖活性。研究结果表明,β-胡萝卜素氧化抑制率为B7CIQE(70.20%)>2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(66.70%)>表没食子儿茶素没食子酸酯(17.80%)>番茄红素(1.90%);油脂开始氧化温度的高低顺序为B7CIQE(175℃)>β-胡萝卜素(165℃)>叶黄素(162℃)>番茄红素(160℃);蛋白质氧化抑制率为B7CIQE(25.75%)>β-胡萝卜素(24.97%)>叶黄素(17.94%)>番茄红素(10.40%);Hep G2细胞抗增殖实验半最大效应浓度为叶黄素(20.86μg/m L)<β-胡萝卜素(124.88μg/m L)
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