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桑黄菌(Phellinus igniarius)是珍稀的药用真菌，主要的活性物质为多糖类物质，也富含黄酮、萜烯类、多酚等小分子化合物，因此具有独特的药用价值和广泛的生物活性。桑黄菌生长缓慢的特点限制了资源的获取，通过传统发酵工艺的优化只适合某种特定菌株及特定条件，并不能广泛适用。本文利用物理诱变手段筛选了高产桑黄菌菌株，利用转录组学技术对诱变机制进行了探索，并优化了超声波对桑黄菌液体发酵促进多糖及黄酮产量的工艺，对桑黄菌渗出液的成分进行了初步的分析。
主要研究工作及结论如下：
(1)桑黄菌菌株鉴定：对桑黄菌菌株经过PCR扩增，获得的序列与GenBank中保存的数据进行相似性分析发现，本研究所使用的桑黄菌菌株与Phellinusbaumii(ident 99%)同源性最高，鉴定结果显示其为Phellinusbaumii。
(2)桑黄菌脉冲强光诱变研究：利用脉冲强光对桑黄菌进行诱变。试验表明，脉冲强光诱变是提高桑黄菌黄酮合成量的一种有效可行的方法，经过5代筛选和5代传代培养，获得了三株高产黄酮的突变株Q12、Q158和QB72，其黄酮含量分别比出发菌株提高了55.41%、40.90%和36.94%；发酵产量比出发菌株分别提高了63.10%、65.49%、51.71%。脉冲强光诱变对多糖的合成影响不大。
(3)桑黄菌脉冲强光-激光联合诱变研究：将脉冲强光单独诱变和脉冲强光与激光联合诱变进行了比较试验。试验发现，脉冲强光与激光的联合诱变效果优于单独的脉冲强光诱变，先激光后脉冲强光的联合诱变效果优于先脉冲强光后激光。桑黄菌经过先激光后脉冲强光的联合诱变，经过漆酶平板5代筛选，及5次传代培养，获得一株优势突变株JQ9，其发酵菌丝体产量提高了46.6%，菌丝体多糖、黄酮、多酚和三萜的产量分别提高了27.17%、68.18%、60.73%和3.6%。推断激光对桑黄菌多糖合成促进起决定性的作用。拮抗实验和同工酶分析表明，优势菌株JQ9发生了突变。
(4)桑黄菌先激光后脉冲强光联合诱变的机理研究：对优势突变菌株JQ9进行转录组测序。利用GO和KEGG等方法对桑黄菌出发菌株与优势突变株JQ9进行基因表达差异研究，对234个上调差异基因进行富集分析，初步选出了8个与生长相关的基因Unigene0003461，Unigene0007569，Unigene0008778，Unigene0010642，Unigene0011209，Unigene0007090，Unigene0011513，Unigene0003209。依据桑黄菌的发酵特点及差异表达情况，进一步确定出的关注基因为Unigene0008778。
(5)超声辅助桑黄菌发酵强化多糖合成条件的优化：经过单因素逐级优化，获得超声波辅助桑黄菌发酵强化多糖合成的最佳条件为：发酵总天数6天、超声波施加时段第2-6天、每天处理2次，每次时长15min、超声频率(20+40)kHz双频组合、超声功率密度40W/L、超声波间歇比10:3。在该条件下，桑黄菌发酵菌丝体多糖含量及多糖发酵产量比对照分别提高26.42%和35.13%。
(6)超声辅助桑黄菌发酵强化黄酮合成条件的优化：经过单因素逐级优化，获得超声波辅助桑黄菌发酵强化黄酮合成的最佳条件为：发酵总天数10天、超声波施加时段第7-9天、每天处理1次、每次时长10min，超声频率(20+40)kHz双频组合，超声功率密度120W/L，超声波处理间歇比10:7。该条件下，桑黄菌发酵菌丝体黄酮含量及黄酮发酵产量比对照分别提高47%和101.81%。
(7)超声辅助桑黄菌发酵强化多糖合成工艺的改进：对超声辅助发酵强化多糖合成、超声辅助发酵强化黄酮合成、发酵前期强化多糖合成和发酵后期强化黄酮合成三种方案进行了对比试验。试验发现，桑黄菌黄酮合成受超声刺激的敏感性远远强于多糖合成。综合多糖和黄酮合成的特点，构建出一个改进型的超声强化多糖合成新工艺，即在2-6天施加超声波强化多糖合成、在7-9天施加超声波强化黄酮合成，菌丝体多糖和黄酮的含量分别提高了25.14%、56.67%；多糖和黄酮的产量分别提高了16.01%、45.02%。该工艺用仅仅2.85%的多糖产量提高量损失，就换来了26.77%的黄酮产量提高量增加。
(8)超声辅助桑黄菌发酵菌丝体的生物学性状分析：以超声波强化黄酮合成的样品为例，利用扫描电镜和透射电镜对超声辅助桑黄菌发酵菌丝体的生物学性状进行了分析。分析发现，超声组的菌丝体表面不平整、扭转、褶皱等，菌丝体粗细不一致，部分菌丝有膨大的现象，甚至有个别的菌丝出现破损的现象，细胞膜的形态有明显改变，说明超声波增加了营养物质和胞内代谢物的交换，改变了菌丝的生长和代谢。
(9)桑黄菌培养中深色分泌渗出物分析：桑黄菌在平板生长一段时间会分泌出深色的渗出物，检测发现其蛋白含量较高，占干物质总量的64%；在游离氨基酸中，必需氨基酸中的苏氨酸含量较高(1.551μmol/g)、非必须氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸含量较高(分别为2.008μmol/g、3.439μmol/g)。培养前期渗出液中含有较多的K、P，后期渗出液中含有较多的Na、Mg、Si、Ca。
主要研究工作及结论如下：
(1)桑黄菌菌株鉴定：对桑黄菌菌株经过PCR扩增，获得的序列与GenBank中保存的数据进行相似性分析发现，本研究所使用的桑黄菌菌株与Phellinusbaumii(ident 99%)同源性最高，鉴定结果显示其为Phellinusbaumii。
(2)桑黄菌脉冲强光诱变研究：利用脉冲强光对桑黄菌进行诱变。试验表明，脉冲强光诱变是提高桑黄菌黄酮合成量的一种有效可行的方法，经过5代筛选和5代传代培养，获得了三株高产黄酮的突变株Q12、Q158和QB72，其黄酮含量分别比出发菌株提高了55.41%、40.90%和36.94%；发酵产量比出发菌株分别提高了63.10%、65.49%、51.71%。脉冲强光诱变对多糖的合成影响不大。
(3)桑黄菌脉冲强光-激光联合诱变研究：将脉冲强光单独诱变和脉冲强光与激光联合诱变进行了比较试验。试验发现，脉冲强光与激光的联合诱变效果优于单独的脉冲强光诱变，先激光后脉冲强光的联合诱变效果优于先脉冲强光后激光。桑黄菌经过先激光后脉冲强光的联合诱变，经过漆酶平板5代筛选，及5次传代培养，获得一株优势突变株JQ9，其发酵菌丝体产量提高了46.6%，菌丝体多糖、黄酮、多酚和三萜的产量分别提高了27.17%、68.18%、60.73%和3.6%。推断激光对桑黄菌多糖合成促进起决定性的作用。拮抗实验和同工酶分析表明，优势菌株JQ9发生了突变。
(4)桑黄菌先激光后脉冲强光联合诱变的机理研究：对优势突变菌株JQ9进行转录组测序。利用GO和KEGG等方法对桑黄菌出发菌株与优势突变株JQ9进行基因表达差异研究，对234个上调差异基因进行富集分析，初步选出了8个与生长相关的基因Unigene0003461，Unigene0007569，Unigene0008778，Unigene0010642，Unigene0011209，Unigene0007090，Unigene0011513，Unigene0003209。依据桑黄菌的发酵特点及差异表达情况，进一步确定出的关注基因为Unigene0008778。
(5)超声辅助桑黄菌发酵强化多糖合成条件的优化：经过单因素逐级优化，获得超声波辅助桑黄菌发酵强化多糖合成的最佳条件为：发酵总天数6天、超声波施加时段第2-6天、每天处理2次，每次时长15min、超声频率(20+40)kHz双频组合、超声功率密度40W/L、超声波间歇比10:3。在该条件下，桑黄菌发酵菌丝体多糖含量及多糖发酵产量比对照分别提高26.42%和35.13%。
(6)超声辅助桑黄菌发酵强化黄酮合成条件的优化：经过单因素逐级优化，获得超声波辅助桑黄菌发酵强化黄酮合成的最佳条件为：发酵总天数10天、超声波施加时段第7-9天、每天处理1次、每次时长10min，超声频率(20+40)kHz双频组合，超声功率密度120W/L，超声波处理间歇比10:7。该条件下，桑黄菌发酵菌丝体黄酮含量及黄酮发酵产量比对照分别提高47%和101.81%。
(7)超声辅助桑黄菌发酵强化多糖合成工艺的改进：对超声辅助发酵强化多糖合成、超声辅助发酵强化黄酮合成、发酵前期强化多糖合成和发酵后期强化黄酮合成三种方案进行了对比试验。试验发现，桑黄菌黄酮合成受超声刺激的敏感性远远强于多糖合成。综合多糖和黄酮合成的特点，构建出一个改进型的超声强化多糖合成新工艺，即在2-6天施加超声波强化多糖合成、在7-9天施加超声波强化黄酮合成，菌丝体多糖和黄酮的含量分别提高了25.14%、56.67%；多糖和黄酮的产量分别提高了16.01%、45.02%。该工艺用仅仅2.85%的多糖产量提高量损失，就换来了26.77%的黄酮产量提高量增加。
(8)超声辅助桑黄菌发酵菌丝体的生物学性状分析：以超声波强化黄酮合成的样品为例，利用扫描电镜和透射电镜对超声辅助桑黄菌发酵菌丝体的生物学性状进行了分析。分析发现，超声组的菌丝体表面不平整、扭转、褶皱等，菌丝体粗细不一致，部分菌丝有膨大的现象，甚至有个别的菌丝出现破损的现象，细胞膜的形态有明显改变，说明超声波增加了营养物质和胞内代谢物的交换，改变了菌丝的生长和代谢。
(9)桑黄菌培养中深色分泌渗出物分析：桑黄菌在平板生长一段时间会分泌出深色的渗出物，检测发现其蛋白含量较高，占干物质总量的64%；在游离氨基酸中，必需氨基酸中的苏氨酸含量较高(1.551μmol/g)、非必须氨基酸中的天冬氨酸和谷氨酸含量较高(分别为2.008μmol/g、3.439μmol/g)。培养前期渗出液中含有较多的K、P，后期渗出液中含有较多的Na、Mg、Si、Ca。