论文部分内容阅读
原花青素(proanthocyanidins简称PC)是一种以黄烷-3-醇为主要结构单元的复杂多酚类植物次生代谢产物。研究表明，PC具有很强的清除自由基、抗氧化活性、调节血压、延缓衰老、抗致癌、抗致突变等一系列重要的保健生理活性，作为一种非常流行的植物提取物，PC已在功能性食品、化妆品的原料市场广泛应用，为加强市场质量监督，迫切需要一套PC有效成分含量和平均聚合度的准确分析方法。本文针对以往PC含量分析方法特异性不强、对照品不一致等缺陷，探索建立了一套更为准确可靠的硫解-HPLC新分析方法，主要结果如下:
1.以葡萄籽PC提取物为原料，经与苄硫醇的硫解反应、硅胶柱层析净化、制备型HPLC纯化等步骤，制备了儿茶素苄硫醚(CA-S)、表儿茶素苄硫醚(EC-S)和表儿茶素没食子酸酯苄硫醚(ECG-S)三种苄硫醚衍生物，经LC-MS、红外吸收光谱、NMR1H谱、13C谱、二维相关谱COSY(Correlation Spectroscopy)、HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)以及HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)分析，结果表明，所制备的3种硫醚衍生物与目标化合物结构一致，经HPLC法检验其纯度不低于98％，符合HPLC分析对照品的纯度要求。对六种PC硫解反应主产物儿茶素(CA)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、CA-S、EC-S、ECG-S以及亲核试剂苄硫醇进行了紫外吸收光谱分析，最大吸收波长分别为280nm、280nm、280nm、280nm、280nm、280nm和305nm。其中CA、EC、ECG、CA-S、EC-S、ECG-S在280nm的摩尔吸光系数分别为0.2609×104、0.2605×104、0.4204×104、0.2605×104、0.2596×104、0.4193×104。
2.以六种硫解反应主产物为对照品，建立了HPLC定量分析方法，并以葡萄籽PC为样品，考察了文献报道的16种PC硫解反应方法的效果，测得PC硫解产物总含量在88.2％～26.0％之间，结果差异显著。对硫解反应产物的酸降解动力学研究表明，黄烷醇单体及其苄硫醚衍生物在酸性、加热的条件下会发生降解反应，且其遵循化学动力学一级反应规律，酸的种类、浓度、反应温度和时间等因素对降解反应有影响。优化的硫解反应条件为:90μL无水乙醇样品溶液，30μL甲酸和30μL10％苄硫醇乙醇溶液(V/V)，反应温度为90℃，反应时间为40分钟。在此条件下，CA、EC、ECG、CA-S、EC-S、ECG-S的保存率分别为88.6％、90.8％、92.6％、63.3％、66.0％和74.3％，依此为修正系数，建立了PC含量分析方法的计算公式。用于四种PC二聚体对照品B1、B2、B3和B4的分析验证，测得其PC含量在98.5％～104％之间，而市售的七种“PC提取物对照品”，PC含量分析结果仅为10.2％～47.8％。六种葡萄籽提取物样品的PC含量为31.2％～98.9％。
3.以优化的葡萄籽PC提取物硫解反应条件为基础，对其它典型的PC提取物样品(山楂、苹果多酚、松树皮和花生衣)的反应条件进行了优化调整，同时，对其PC含量及平均聚合度(mDP)的计算公式也进行了相应修正。山楂PC硫解反应条件调整为20μL甲酸，反应时间为30分钟;苹果多酚硫解反应条件调整为40μL甲酸，反应时间为40分钟;松树皮PC提取物反应条件为40μL甲酸，30分钟;花生衣PC提取物反应条件为40μL甲酸，反应时间50分钟。其余条件均与葡萄籽PC相同。
4.对开发的硫解-HPLC法与优化后的香草醛法、正丁醇盐酸-HPLC法进行了对比和评价，三种测定方法的线性相关系数均≥0.9990，LOD分别为:≤2.20ng(0.44μg/mL)、2.21μg/mL和7.30ng(0.73μg/mL)，RSD分别为:≤0.75％、1.56％和1.24％，加标回收率分别为:≥98.0％、94.1％和97.5％。用这三种方法对含量为2.00mg/mL的PCB2样品溶液进行含量分析验证，测定结果(平均值±SD)分别为2.00±0.09mg/mL，1.83±0.10mg/mL，1.14±0.11mg/mL。对市售的葡萄籽、葡萄皮、花生衣及松树皮的共计21份PC提取物样品进行含量分析，三种方法的测定结果(平均值±SD)分别为:38.2％±8.69％，48.5％±7.63％和42.3％±8.10％。香草醛法与正丁醇盐酸-HPLC法检测结果间的相关系数最高，为0.9212＞r0.01=0.5490，其次正丁醇盐酸-HPLC法与硫解-HPLC法之间的相关系数为0.6636＞r0.01=0.5490，香草醛法与硫解-HPLC法之间的相关系数为0.6143＞r0.01=0.5490，表明不同方法所得检测结果之间相互印证的效果极显著。采用硫解-HPLC法分析21份样品PC的平均聚合度在1.26～8.33之间。通过方差分析，可得知方法、样品以及两者的交互作用都对原花青素含量的影响达到了极显著的水平。
1.以葡萄籽PC提取物为原料，经与苄硫醇的硫解反应、硅胶柱层析净化、制备型HPLC纯化等步骤，制备了儿茶素苄硫醚(CA-S)、表儿茶素苄硫醚(EC-S)和表儿茶素没食子酸酯苄硫醚(ECG-S)三种苄硫醚衍生物，经LC-MS、红外吸收光谱、NMR1H谱、13C谱、二维相关谱COSY(Correlation Spectroscopy)、HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)以及HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)分析，结果表明，所制备的3种硫醚衍生物与目标化合物结构一致，经HPLC法检验其纯度不低于98％，符合HPLC分析对照品的纯度要求。对六种PC硫解反应主产物儿茶素(CA)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、CA-S、EC-S、ECG-S以及亲核试剂苄硫醇进行了紫外吸收光谱分析，最大吸收波长分别为280nm、280nm、280nm、280nm、280nm、280nm和305nm。其中CA、EC、ECG、CA-S、EC-S、ECG-S在280nm的摩尔吸光系数分别为0.2609×104、0.2605×104、0.4204×104、0.2605×104、0.2596×104、0.4193×104。
2.以六种硫解反应主产物为对照品，建立了HPLC定量分析方法，并以葡萄籽PC为样品，考察了文献报道的16种PC硫解反应方法的效果，测得PC硫解产物总含量在88.2％～26.0％之间，结果差异显著。对硫解反应产物的酸降解动力学研究表明，黄烷醇单体及其苄硫醚衍生物在酸性、加热的条件下会发生降解反应，且其遵循化学动力学一级反应规律，酸的种类、浓度、反应温度和时间等因素对降解反应有影响。优化的硫解反应条件为:90μL无水乙醇样品溶液，30μL甲酸和30μL10％苄硫醇乙醇溶液(V/V)，反应温度为90℃，反应时间为40分钟。在此条件下，CA、EC、ECG、CA-S、EC-S、ECG-S的保存率分别为88.6％、90.8％、92.6％、63.3％、66.0％和74.3％，依此为修正系数，建立了PC含量分析方法的计算公式。用于四种PC二聚体对照品B1、B2、B3和B4的分析验证，测得其PC含量在98.5％～104％之间，而市售的七种“PC提取物对照品”，PC含量分析结果仅为10.2％～47.8％。六种葡萄籽提取物样品的PC含量为31.2％～98.9％。
3.以优化的葡萄籽PC提取物硫解反应条件为基础，对其它典型的PC提取物样品(山楂、苹果多酚、松树皮和花生衣)的反应条件进行了优化调整，同时，对其PC含量及平均聚合度(mDP)的计算公式也进行了相应修正。山楂PC硫解反应条件调整为20μL甲酸，反应时间为30分钟;苹果多酚硫解反应条件调整为40μL甲酸，反应时间为40分钟;松树皮PC提取物反应条件为40μL甲酸，30分钟;花生衣PC提取物反应条件为40μL甲酸，反应时间50分钟。其余条件均与葡萄籽PC相同。
4.对开发的硫解-HPLC法与优化后的香草醛法、正丁醇盐酸-HPLC法进行了对比和评价，三种测定方法的线性相关系数均≥0.9990，LOD分别为:≤2.20ng(0.44μg/mL)、2.21μg/mL和7.30ng(0.73μg/mL)，RSD分别为:≤0.75％、1.56％和1.24％，加标回收率分别为:≥98.0％、94.1％和97.5％。用这三种方法对含量为2.00mg/mL的PCB2样品溶液进行含量分析验证，测定结果(平均值±SD)分别为2.00±0.09mg/mL，1.83±0.10mg/mL，1.14±0.11mg/mL。对市售的葡萄籽、葡萄皮、花生衣及松树皮的共计21份PC提取物样品进行含量分析，三种方法的测定结果(平均值±SD)分别为:38.2％±8.69％，48.5％±7.63％和42.3％±8.10％。香草醛法与正丁醇盐酸-HPLC法检测结果间的相关系数最高，为0.9212＞r0.01=0.5490，其次正丁醇盐酸-HPLC法与硫解-HPLC法之间的相关系数为0.6636＞r0.01=0.5490，香草醛法与硫解-HPLC法之间的相关系数为0.6143＞r0.01=0.5490，表明不同方法所得检测结果之间相互印证的效果极显著。采用硫解-HPLC法分析21份样品PC的平均聚合度在1.26～8.33之间。通过方差分析，可得知方法、样品以及两者的交互作用都对原花青素含量的影响达到了极显著的水平。