背景:肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一类成年发病并且伴随进行性发展的神经退行性疾病,目前尚无有效的治疗方法。自噬对于此类疾病中出现的毒性蛋白聚集的质量控制具有重要意义,而转录因子EB(TFEB)是调控自噬的主要角色。目的:研究氧化条件下TFEB对细胞自噬调控的影响,以及该影响是否依赖于TFEB自身的氧化修饰,并在此基础上找出TFEB上可能的氧化修饰位点以及氧化应激条件下TFEB入核的机制。方法:在HEK293细胞中分别过表达带有绿色荧光蛋白的野生型和突变了可能存在氧化修饰的位点的TFEB的质粒,分别对野生型和突变型以过氧化氢(双氧水)、加药(mTOR抑制剂Torin-1)和饥饿处理,使用荧光显微镜、核质分离实验和Western Blotting(蛋白质免疫印迹法)等实验方法检测TFEB在胞质胞核中的分布以及细胞自噬的水平。双荧光法监测自噬流。用免疫共沉淀来验证双氧水影响TFEB与Rag GTPases的结合。结果:双氧水处理条件下,短时间内,野生型TFEB迅速进核,而突变型TFEB大部分停留在胞质中,并且突变型自噬水平的升高明显低于野生型;Torin-1和饥饿分别处理条件下,野生型和突变型TFEB的入核需要较长时间。双氧水诱导自噬增加。加入双氧水后TFEB与Rag GTPases的结合消失。结论:(1)氧化条件下,短时间内TFEB主要通过自身氧化导致其入核从而上调细胞自噬,此时TFEB的入核途径不同于mTOR抑制条件下及饥饿条件下的入核途径。(2)实验所设计的突变体顺利找到并证实了TFEB上的氧化修饰位点,该位点的存在使得TFEB可直接通过自身氧化修饰位点的氧化而迅速产生入核的应答。(3)双氧水破坏TFEB与Rag GTPases的结合进而TFEB入核