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奶牛乳腺炎是一种受遗传、环境等多种因素影响的炎症性疾病,在其发生过程中有多种免疫相关基因参与。HMGB是一种核内非组蛋白,包括HMGB1、HMGB2和HMGB3,是由核酸受体介导的先天免疫反应的普适性“哨兵”。基因启动子、可变剪切体和miRNA在基因表达的转录与转录后调控中发挥重要作用,并且在免疫反应中扮演重要角色。本实验通过研究HMGB3和HMGB1基因的表达与分子调控机制,挖掘出与奶牛乳中体细胞评分相关的功能性SNPs,筛选乳腺炎抗性基因型,为乳腺炎抗性育种提供实验依据。实验分为四部分：一HMGB3基因及其剪接体在奶牛体组织中的表达分析HMGB3在启动先天性免疫反应的过程中发挥着重要作用,为了初步探索HMGB3基因两种剪接体的表达量与奶牛乳腺炎之间的相互关系,采用RT-PCR方法测定HMGB3基因两种剪接体(TV1/TV2)在患乳腺炎乳腺组织和健康奶牛乳腺、肝、脾、肺、肾、肌肉组织中的表达量,并且用Q-PCR技术测定了HMGB3基因总RNA在上述组织中的表达量。结果显示,TV1在乳腺组织中表达量最高,患病乳腺显著高于健康乳腺、肝、脾和肌肉的表达量；TV2在肝脏中表达量最高,在患病牛乳腺组织(n=5)的表达量明显高于正常组(n=5),在肌肉、肝、肾、脾、肺中也有不同程度的表达；在乳腺组织HMGB3基因表达量最高,患病奶牛乳腺组织(n=5)的表达量是健康奶牛(n=5)的8.5倍(P<0.05),健康奶牛中,乳腺组织表达量高于肌肉、肝、肾、脾,而在肺中不表达(P<0.05)。二奶牛HMGB3基因启动子活性分析与功能SNPs鉴定启动子决定基因转录起始点和转录频率,控制基因表达的起始时间和强弱程度,然而牛HMGB3基因的启动子特性及其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究采用生物信息学分析、基因克隆、DNA测序、双荧光素酶基因报告系统和PCR-RFLP等技术手段,构建牛HMGB3基因5’侧翼区包含预测的两个启动子(P1,P2)7个片段的pGL3-basic重组质粒和包含位于内含子三的第三启动子(P3)g.+2690位置上不同单倍型(C/T)的两个pEGFP-N1重组质粒,分别转染293T细胞,对不同片段的启动子活性进行定性或定量测定。结果显示,P1和P2的核心序列分别是g.-655～g.-114和g.-116～g.+301区域,位于P3g.+2690位点突变型TT启动子活性较野生型CC高,突变的发生有助于HMGB3基因的表达。接着对302头中国荷斯坦牛HMGB3基因P3的g.+2690位点进行基因分型,经χ2适合性检验,SNP不处于Hardy—Weinberg平衡状态,同时结合奶牛的体细胞评分(SCS)数据,用最小二乘方模型分析SNP与SCS的相关性,发现该SNP对奶牛乳腺炎有显著影响,g.+2690C>T-TT突变基因型个体牛的SCS较野生和杂合基因型低(P<0.05),为乳腺炎抗性的优良基因型。本研究利于以后更好地研究HMGB3基因的生物功能,并为乳腺炎抗性育种提供一个新的方法。三奶牛HMGB3基因靶标miRNAs的表达分析miRNAs是一类长约18～24nt的单链、内源性、非编码小分子RNA,以部分序列互补的方式结合在基因3’UTR通过抑制mRNA的翻译或者使其降解的方式对基因进行转录后调控,可以调节先天性和适应性免疫反应。本实验为了确定靶向作用于HMGB3基因的miRNAs,用TargetScan Human,RNA22和Patrocles软件分析了与HMGB3基因结合的miRNAs,找出预测结果重合并位于HMGB3基因3’UTR守区的三种miRNAs: bta-miR-17-5p、miR-20b和miR-93,并采用Q-PCR的方法分析其健康和患乳腺炎乳腺组织中的表达差异,结果显示,和健康乳腺组织相比bta-miR-17-5p、miR-20b和miR-93在患病乳腺组中的表达量分别下调1.56、1.72和2.94倍(P<0.05)。提示,这三种miRNA可能靶向于HMGB3基因,并与奶牛乳腺炎有关。四奶牛HMGB1基因靶标miRNA表达分析及SNP功能研究HMGB1是一种重要的炎症介质,可以参与调节炎症和自身免疫性疾病。为了研究位于HMGB1基因3’UTR的功能性SNP是否影响bta-miR-223与HMGB1基因的结合,用Q-PCR的方法分析HMGB1基因mRNA在不同基因型奶牛乳腺组织中的表达以及bta-miR-223在正常和患乳腺炎乳腺组织中的表达。结果显示,g.+2776位点为GG基因型的奶牛乳腺组织中的HMGB1mRNA表达量显著高于AA基因型奶牛(p<0.05),患乳腺炎的乳腺组织中bta-miR-223的表达量是其在正常乳腺组织的1.95倍(P<0.05)；通过荧光素酶检测发现在293T细胞中HMGB1基因的表达受bta-miR-223的调控,位于HMGB13’UTR这个新的SNP(g.+2776A>G)不仅影响bta-miR-223和HMGB1基因的结合,而且还与奶牛SCS有相关性,g.+2776A>G-GG是奶牛乳腺炎抗性基因型,可以作为潜在的奶牛乳腺炎抗性育种的功能性分子标记。