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目的:本课题旨在比较光滑钛表面(smooth titanium,ST)、微米级形貌钛表面(micro titanium,MT)、纳米级形貌钛表面(nano titanium,NT)对MC3T3-E1形态、粘附、增殖、成骨分化能力的影响,并探究其与MC3T3-E1线粒体分裂融合(mitochondrial fission and fusion,MFF)平衡的相关性及初步机制。方法:1.材料学研究:通过碳化硅砂纸梯度抛光制备ST,并在ST的基础上通过1.25 wt.%氢氟酸(hydrofluoric acid,HF)酸蚀3 min制备MT,20 V、无机电解液体系阳极氧化1 h制备NT;采用体视显微镜(stereoscopic microscope,SM)大体观察不同钛片,采用场发扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FE-SEM)、原子力学显微镜(atomic force microscope,AFM)对表面不同微观形貌进行观察,并分析粗糙度,采用接触角测量仪评估不同表面亲水性。2.细胞学评估:在材料学研究的基础上,采用FE-SEM对第3 d表面粘附细胞的形态进行观察,采用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察第3 d表面粘附细胞的骨架,采用4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染色对30min、60 min、120 min表面细胞粘附能力进行检测,采用CCK-8对1、3、5、7 d表面细胞增殖活性进行检测,评估不同形貌表面MC3T3-E1的表型、生物活性;采用定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)对第7 d细胞成骨相关分子进行检测,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色对第7 d ALP活性进行检测,采用茜素红染色对第21 d细胞成骨矿化能力进行检测;采用qPCR检测不同表面接种1 d、2 d、3 d后MC3T3-E1 MFF相关分子,采用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察第7 d线粒体的形态、数目,采用Mito-tracker Green对第7 d线粒体进行标记、观察,通过qPCR对第7 d MFF相关分子表达水平进行检测,采用Western blot对第7 d线粒体分裂相关的动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)的表达水平进行检测,采用免疫荧光染色对第7d DRP1空间定位、表达进行观察分析,评估不同形貌表面MC3T3-E1 MFF状态。3.分子机制探索:在细胞学评估的基础上,采用DCFH-DA化学荧光法对第3 d ST组、NT组活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平进行检测,探索不同形貌表面通过影响MC3T3-E1 ROS水平影响DRP1表达的可能性;采用qPCR、Western blot法对不同DRP1-siRNA转染24 h后DRP1表达水平进行检测,结合qPCR对线粒体融合相关分子(mitofusin 1,MFN1;mitofusin 2,MFN2;optic atrophy 1,OPA1)进行检测,筛选沉默效率最佳的DRP1-siRNA,并采用Mito-tracker Green对转染效果进行验证;NT组DRP1-siRNA转染24 h后成骨诱导3 d、7 d,采用qPCR法对成骨相关分子表达水平进行检测,采用ALP染色检测ALP活性,探索纳米形貌表面影响DRP1表达干预MFF平衡对MC3T3-E1成骨分化能力的影响。结果:1.ST组表面平整、光滑如镜,MT组表面灰白色,呈现阶梯状、边缘锐利的微米台阶结构,NT组外表金黄色,呈现均匀分布、约100 nm管径的纳米管结构;表面水接触角ST组>MT组>NT组。2.第3 d,ST组细胞铺展,伪足细而分散,骨架排列分布均匀、一致,MT组、NT组细胞细长、呈纺锤形状伸展,伪足粗大,骨架极性排列;每视野下细胞粘附量、细胞增殖活性总体呈现NT组>MT组>ST组;成骨诱导7 d后,较ST、MT组,NT组中成骨相关基因(ALP;osteocalcin,OCN;osteopontin,OPN;Runt-related transcription factor 2,Runx2)表达显著上升,ALP活性、成骨矿化能力最强;与ST组相比,MT组、NT组第1 d、2 d线粒体分裂相关分子DRP1表达有显著上升的趋势,融合相关分子MFN1、MFN2、OPA1有降低的趋势,第3 d DRP1表达显著下降,MFN1、MFN2、OPA1表达显著上升;TEM结果显示:第7 d,ST组线粒体短小,可见分裂状线粒体,MT组、NT组线粒体粗长而连续;第7 d,较ST组,MT组、NT组线粒体呈网络状,DRP1表达降低,免疫荧光可见线粒体分裂处DRP1定位,且DRP1表达量ST组最高。3.DCFH-DA染色结果显示:ROS水平ST组>NT组;筛选后DRP1-siRNA可有效降低DRP1表达水平,线粒体呈网络状融合状态;较未转染组,DRP1-siRNA组成骨诱导3 d,成骨相关基因ALP、Runx2显著降低,成骨诱导7 d,ALP显著降低;ALP染色结果同样提示DRP1-siRNA组成骨诱导7 d后,ALP活性显著降低。结论:1.通过梯度抛光法、HF酸蚀法、阳极氧化法可成功制备ST、MT和NT,且NT表面粗糙度最大、亲水性最佳。2.NT表面MC3T3-E1伸展良好,与ST、MT表面相比,NT表面细胞粘附数量最多、增殖活性最高、成骨分化能力最强。3.形貌与MC3T3-E1 MFF平衡存在一定联系,主要表现为:与ST表面相比,MT、NT表面线粒体初期(1 d,2 d)以分裂为主,DRP1表达显著上升,后期(3 d,7 d)以融合为主,DRP1表达显著下降。4.NT表面MC3T3-E1中的低水平ROS可能是DRP1的上游分子。DRP1-siRNA可有效降低DRP1表达水平干预MFF平衡,但仅通过DRP1-siRNA干预NT表面MFF平衡,MC3T3-E1成骨分化能力反而降低。