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目的:卡马西平(Carbamazepine,CBZ)又称酰胺咪嗪,与三环类抗抑郁药结构相似,通过阻断电压依赖性钠离子通道,减少突触前谷氨酸(Glu)释放和细胞内环磷酸腺苷(c AMP)水平,增加脑内5-羟色胺(5-HT)水平,从而降低神经元兴奋性。CBZ作为一线抗癫痫药物(antiepileptic drugs,AEDS),因其价格低廉,疗效显著,临床应用非常广泛。但AEDS疗程长、依从性差且个体间不良反应差异大、副作用多,症状表现各异,可累及多个器官及系统。丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)在改善脑缺血、促进脑缺血后神经功能恢复方面有明显效果,近期研究证明,NBP不仅从形态和功能上对线粒体发挥保护作用,还可以降低神经细胞凋亡百分率,并能上调大鼠缺血脑组织中的BDNF的表达,达到神经保护作用。为排除癫痫发作本身对认知功能及凋亡的损害,了解CBZ对认知损伤的差异性,本实验以形态学为基础,通过观察CBZ及NBP对大鼠海马CA1区、CA3区、小脑神经细胞凋亡及认知的影响,探讨CBZ对神经系统毒副作用以及NBP抑制凋亡、改善认知的作用机制,为更好地指导临床用药、减少药物不良反应提供理论依据。方法:1实验动物及分组:7周龄健康雄性成熟SD(Sprague-Dawley)大鼠(河北医科大学实验动物中心提供)36只,实验起始体重150~190g;自然昼夜,22~25℃环境喂养,每笼6只,换气扇通风,标准饲料喂养,自由进食和饮水。随机分为YY组(NS+花生油),NBP组(NBP+花生油+NS组),C1组(CBZ低剂量+NS+花生油组),C2组(CBZ高剂量+NS+花生油),NC1组(CBZ低剂量+NS+NBP+花生油),NC2组(CBZ高剂量+NS+NBP+花生油),每组6只。按人与大鼠给药剂量的换算公式(以公斤体重计算,大鼠的剂量为人用药剂量的6.25倍),具体为低剂量CBZ 125mg/kg/d,NBP 80mg/kg/d,高剂量CBZ采取LD50的1/8,具体剂量为高剂量CBZ 500mg/kg/d,一天一次灌胃器灌胃30天。2灌注及取材:10%的水合氯醛麻醉后仰卧固定,剪开胸骨,暴露心脏,灌注针经心尖部入左心室经主动脉瓣入升主动脉,同时剪开右心耳放血,先快速注入生理盐水,以止血钳夹固灌注针,右心耳流出无色液体后,用4%的多聚甲醛固定,待灌注成功后立即断头取材,放入4%的多聚甲醛固定液中进行固定24小时。标本经过脱水、透明、石蜡包埋及切片,供HE、尼氏染色、免疫组化测定使用。另外每组随机选取2只大鼠麻醉后用1%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1M磷酸缓冲液灌流固定后,取大鼠海马区域的脑组织标本,经透射电子显微镜观察海马组织CA1区神经元及小脑浦肯野细胞结构。3凋亡及认知指标测定:大鼠海马CA1区、CA3区及小脑皮质浦肯野细胞蜡切片经HE染色光镜下观察大鼠脑组织的形态学变化,尼氏染色观察尼氏小体的变化,水迷宫观察大鼠认知行为学的变化,免疫组化染色法观察凋亡相关基因Bax及Bcl-2的表达情况和认知相关基因BDNF的表达情况。4统计学处理:应用SPSS 13.0软件对数据进行处理。多组间均数显著性检验应用One-Way ANOVA,其中方差齐性资料采用SNK检验进行两两组间比较;非齐性资料用Tamhane’S T2检验,当P<0.05时认为差异具有显著性。结果:1 HE染色结果1.1海马CA1及CA3区:各组脑组织结构完整,细胞密集,排列整齐。偶见细胞皱缩,与周围细胞分离,嗜酸性染色增强,细胞核、染色质聚集成团块状,与YY组相比,无明显形态学改变。1.2小脑浦肯野细胞:各组可见浦肯野细胞密集,排列整齐,偶见细胞体积缩小,与YY组相比,无明显形态学差异。2尼氏染色结果2.1海马CA1及CA3区:各组海马锥体细胞密度大且排列规则,细胞质染色清晰,呈均匀一致的紫蓝色,胞浆中可见尼式小体,神经元未见异常形态改变。2.2小脑浦肯野细胞:Nissl染色能显示浦肯野细胞胞体及与连接胞体的主树突,胞质中可见成斑块状堆积的蓝紫色尼体小体,胞核及其核仁清晰可见,神经元未见异常形态改变。3免疫组化染色法检测Bax、Bcl-2及BDNF表达结果3.1 Bax表达结果3.1.1海马CA1区:CBZ组可见Bax表达阳性细胞明显增多,胞浆呈棕黄色,染色较深。YY组和NBP组可见Bax表达阳性细胞稀疏、散在分布,且染色浅淡。通过采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统测定Bax表达阳性细胞的平均光密度值(OD值),C1组与C2组相比Bax表达差异无统计学意义(P>0.05),该两组的Bax表达比其余四组均增高,与其余四组相比差异均有统计学意义(P<0.01);NC1组与NC2组相比Bax表达差异无统计学意义(P>0.05),该两组与C1组与C2组相比的Bax表达减少,差异有统计学意义(P<0.01),与YY组与NBP组相比Bax表达增高,差异有统计学意义(P<0.01)。3.1.2海马CA3区:各组均可见少量、散在分布的Bax表达阳性细胞,测定Bax表达阳性细胞的OD值,C1组与C2组相比Bax表达差异无统计学意义(P>0.05),该两组的Bax表达比其余四组均增高,与其余四组相比差异均有统计学意义(P<0.01);NC1组与NC2组相比Bax表达差异无统计学意义(P>0.05),该两组与C1组及C2组相比的Bax表达减少,差异有统计学意义(P<0.01),与YY组及NBP组相比Bax表达增高,差异有统计学意义(P<0.01)。3.1.3小脑浦肯野细胞区:NC1组与NC2组相比Bax表达差异无统计学意义(P>0.05),该两组与C1组及C2组相比Bax表达减少,差异有统计学意义(P<0.01),与YY组及NBP组相比Bax表达增高,差异有统计学意义(P<0.01);NBP组比YY组Bax表达减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.2 Bcl-2表达结果3.2.1海马CA1区:C1组和C2组Bcl-2表达阳性细胞显著增多,胞质呈棕黄色或褐色,染色较深。NBP组和YY组Bcl-2表达阳性细胞稀疏、散在分布,细胞着色浅淡。CBZ+NBP组Bcl-2表达阳性细胞着色较CBZ组明显稍浅。通过采用Image Pro Plus 6.0图像分析系统测定Bcl-2表达阳性细胞的平均光密度值(OD值),各组之间相比存在差异,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.2.2海马CA3区:各组均可见Bcl-2表达阳性细胞广泛分布,胞质深染呈棕黄色或褐色,测定Bcl-2表达阳性细胞的OD值,各组之间Bcl-2表达存在差异但无统计学意义(P>0.05)。3.2.3小脑浦肯野细胞区:各组之间Bcl-2表达存在差异但无统计学意义(P>0.05)。3.3 BDNF表达结果3.3.1海马CA1区:在放大400倍的光学显微镜下观察,BDNF免疫组织化学阳性细胞主要集中在海马CA1区、CA3区锥体细胞,表现为整个细胞胞浆着色呈棕黄色,各组均可见BDNF表达,表达量较高,各组OD值相比,但差异均无统计学意义(P>0.05)。3.3.2海马CA3区:各组均可见BDNF表达,但差异均无统计学意义(P>0.05)。3.3.3小脑浦肯野细胞区:BDNF在海马表达的最多,浦肯野细胞的BDNF表达明显减少。对数据进行统计学分析得出:各组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。4水迷宫结果4.1水迷宫逃避潜伏期结果:从训练的第2天开始,六组大鼠逃避潜伏期均有下降的趋势,说明训练可以增强学习记忆能力,各组大鼠通过4天的训练,建立了空间记忆(p<0.01),但各组大鼠间学习记忆能力无明显不同(P>0.05)。4.2水迷宫穿越平台次数结果:各组之间穿越平台次数的均数比较存在差异,但无统计学意义(P>0.05)。5透射电镜观察结果5.1海马CA1区:各组海马CA1区细胞大体结构未发现异常,细胞内神经元核膜清晰,核质均匀,核膜无内陷,胞质中细胞器丰富,胞质内可见大量的核糖体,线粒体无肿胀、线粒体嵴无断裂,粗面内质网池无扩张。5.2小脑浦肯野细胞区:各组浦肯野细胞细胞大体结构未发现异常。细胞内神经元核膜清晰,核质均匀,核膜无内陷,胞质中细胞器丰富。结论:1灌服常规剂量卡马西平,对正常成年SD大鼠海马及小脑Bax、Bcl-2表达有影响,对神经元形态结构及认知功能无明显改变,说明卡马西平短期服用对神经元的损害可能是可逆的,且机体的自身调节使凋亡难度增加,可能是一种机体对药物损害的保护性反应;2卡马西平对正常大鼠认知功能无明显影响;3丁苯酞对正常大鼠认知及凋亡无明显影响,对海马神经元无损伤;4丁苯酞对卡马西平造成的正常成年SD大鼠海马CA1区、CA3区、小脑浦肯野细胞区Bax表达有降低作用。