中药寒热药性一直是中医药研究的热点和难点,中药现代化迫切需要现代科学技术手段来充分说明中药药性理论、中药药效作用的物质基础、作用机理和配伍等丰富的科学内涵。当今科学技术的融入使中药药性理论又上升到了一个新的高度。本文依据导师的中药性味科学内涵新假说,探讨寒性、热性中药对能量代谢及相关蛋白表达的影响,分析寒性、热性中药在性味—功效—药理作用上的共性和差异性,本研究望为中药寒热药性现代化研究提供新的研究视角与实验依据。为此,本论文开展了以下几个方面的研究工作:1通过检索大量国内外文献,完成了关于中药性味理论的研究综述。通过对蛋白质组学及中医寒、热证动物模型文献的整理,明确了中药性味理论研究的方法和模式,从而为本论文的开展奠定了扎实的文献资料基础。2蛋白质组学在世界范围内受到越来越多的关注。蛋白质组学已成为现代生命科学领域中的热点之一,在中药药性理论研究中也得到了越来越多的应用。蛋白质组学是功能基因组学的重要组成,因此,生命科学的研究重心从基因组学转移到蛋白质组学。目前,同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术是蛋白质组学的核心技术。iTRAQ技术是近年来新开发的一种蛋白质组学定量研究技术,具有较好的定量效果、较高的重复性,可以对8种不同样本同时进行定量分析。许多研究表明,iTRAQ技术为中药药性理论研究提供了一个强大的平台,能鉴定出不同的生理或病理条件下的差异表达蛋白。我们采用一种成熟的技术来研究肝脏、血清、下丘脑、肝微粒体中的蛋白质组学,深度和广度的探索中药药性理论。我们的研究为中药药性理论提供了新的数据和平台,更深一步的研究能全面诠释导师的“中药性味科学内涵新假说”。3采用典型寒性、热性、平性中药对动物机体多项生理生化指标结合病理组织学,从肝脏、脾脏、肺、下丘脑、肾脏等病理变化探讨中药药性,并对这些生理生化指标的变化进行了寒热共性分析。热性中药附子、干姜、花椒对寒证病理变化能明显改善,对热证模型病理变化有加重趋势;寒性中药对寒证模型病理变化有加重趋势,对热证模型病理变化能明显改善。同时寒性中药能够减少机体能量储备,能显著降低机体肝脏的ATP、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase酶的活性,热性中药能够增加机体能量储备,能显著升高机体肝脏的ATP、Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase酶的活性。初步明确中医理论“治寒以热,治热以寒”的观点,明确治疗寒热病证的原则,为中医临床用药提供理论依据;也进一步明确寒性、热性中药对能量代谢有一定的影响。4取一定量的组织,差速离心法提取蛋白,BCA蛋白定量和SDS-PAGE检测蛋白完整性,应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合2D LC-MS/MS筛选组织中的差异蛋白。在肝脏、血清、下丘脑、肝微粒中,寒性中药黄连、黄芩、黄柏共鉴定出85个差异蛋白,这些差异蛋白主要参与胰岛素信号转导通路、PPAR信号通路、淀粉和蔗糖代谢、脂肪酸生物合成、甾体合成、三羧酸循环、钙信号转导通路、Wnt信号通路、长时程增强等途径减少机体能量生成,降低对能量的利用,抑制机体能量代谢和物质代谢。现代药理研究表明,这些差异蛋白在抗肿瘤、感染、冠心病等热证疾病中发挥治疗作用。热性中药附子、干姜、花椒共鉴定出127个差异蛋白,通过显著影响糖代谢、磷酸戊糖途径、氨基酸代谢,脂肪酸代谢、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、维生素A代谢、三羧酸循环(TCA循环)等途径增加机体能量生成,提高机体能量利用。同时筛选出的差异蛋白在肝癌、衰老、心肌梗死等疾病中发挥治疗作用。研究结果为以“中药同时具有性(气)与味,性(气)与味是中药(包括方剂、单味中药、有效部位或组分、单体化合物)同时兼具的两种特性。药味与药物的具体功效相关。药性(气)是药物通过不同途径以主要影响机体的能量代谢、物质代谢为特征的,可影响药物疗效发挥或与副作用发生有关的一类生物学效应。”的中药性味理论新假说的客观性提供了科学依据,同时为评价中药寒热药性提供了新的方法。5为了便于分析蛋白质-蛋白质相互作用数据,从代谢途径、结合实验和药物-靶点的相互作用的信息。从表型效应得到的信息推断,挖掘出化学结构相似的蛋白来预测中药药性和能量的关系。应用STRING对差异蛋白进行蛋白相互作用分析,采用Cytoscape软件进行可视化,寒性、热性中药在肝脏、血清、下丘脑、肝微粒蛋白相互作用中分别预测出30个关联蛋白。6对乙酰氨基酚(APAP)广泛应用于止痛和退烧,正常剂量使用,APAP是安全的、不会产生严重的副作用。然而,过量使用,常常导致严重的甚至致命的肝毒性。黄药子也是临床常用药,临床作用广泛,但是黄药子有毒,容易引起药源性肝损伤。观察黄连、黄芩、黄柏对黄药子和对乙酰氨基酚所致肝毒性的缓解作用。黄药子、对乙酰氨基酚致大鼠肝毒性模型成功,肝细胞溶解、肿胀、脂肪变性,间隙有炎性细胞,肝组织可见局部点状、片状水肿变性,部分坏死。肝功能相关指标(ALT,AST,ALP)显著升高,具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。黄连、黄芩、黄柏对黄药子、对乙酰氨基酚引起的肝毒性具有保护作用,能使血清丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性显著降低(P<0.05或P<0.01),肝组织MDA含量显著降低(P<0.05或P<0.01)和GSH含量显著提高(P<0.05或P<0.01),肝组织细胞的病变程度得到明显改善。黄连、黄芩和黄柏是通过提高肝脏的GSH和抗氧化水平,及降低血清ALT,ALP和AST水平,减轻肝组织细胞的损伤,达到保肝的效果。