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奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)耐药是肝癌治疗中的巨大障碍,上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)已被证实与奥沙利铂耐药密切相关。RNA结合基序蛋白8A(RNA binding motif protein 8a,RBM8A)是外显子连接复合物的核心组件,同时也是无义介导的m RNA衰变中所必需的蛋白之一,与RNA定位、转录、转运、翻译和降解等有关,同时还与细胞周期调控和细胞凋亡调控密切相关,现有研究证实RBM8A广泛参与肿瘤发展。我们前期研究发现:RBM8A在肝癌组织中高表达,与患者不良预后相关;RBM8A高表达可诱导体外细胞株的EMT,抑制肝细胞癌凋亡,促进其增殖、迁移和侵袭能力。但RBM8A能否通过所诱导的EMT参与奥沙利铂耐药尚不清楚。如果有两者有关系,其具体的分子机制如何?目前尚无相关研究报道。为进一步了解RBM8A在肝癌OXA耐药中发挥的作用,并阐明RBM8A在肝癌耐药网络中的分子机制,进而探索出逆转肝癌耐药的潜在药物靶点,本研究应用RBM8A低表达及过表达的肝细胞癌OXA耐药模型和裸鼠皮下耐药移植瘤模型,检测各组细胞肿瘤相关功能、耐药性和EMT特征的改变情况,观察RBM8A在肝癌OXA耐药中的作用,通过高通量芯片技术结合生物信息学方法,分析并验证其潜在的下游调控因子和信号通路。本课题将从以下三个章节内容开展研究。第一章RBM8A在肝细胞癌对奥沙利铂耐药中的初步作用研究目的:通过构建RBM8A低表达及过表达的肝细胞癌OXA耐药模型和裸鼠皮下耐药移植瘤模型,检测RBM8A改变后对细胞功能、耐药性和移植瘤生长的影响,初步探讨RBM8A与肝癌OXA耐药发生发展的相关性。方法:1.采用OXA浓度递增法,间歇作用诱导建立耐药肝细胞癌模型BEL-7404/OXA和MHCC-97H/OXA,运用转染过表达技术和RNA干扰技术分别建立稳定的亲本肝细胞癌模型MHCC-97H-RBM8A-OE、BEL-7404-RBM8A-KD以及OXA耐药肝细胞癌模型MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE、BEL-7404/OXA-RBM8A-KD;2.CCK-8法检测各组细胞增殖能力和IC50变化;3.流式细胞仪器检测各组细胞凋亡和细胞周期变化;4.Western Blot法检测各组细胞耐药相关蛋白ABCG2、ABCB1、ABCC1变化;5.利用BEL-7404/OXA-RBM8A-KD细胞和BEL-7404/OXA-RBM8ANC细胞构建裸鼠皮下耐药移植瘤模型,观察对比两组瘤体生长速度、大小和体积。结果:1.RBM8A在耐药肝细胞癌MHCC-97H/OXA、BEL-7404/OXA中较亲本肝细胞癌MHCC-97H-NC、BEL-7404-NC中表达显著升高;2.BEL-7404/OXA-RBM8A-KD细胞增殖能力下降、凋亡明显增加,细胞周期G1期数目增加;MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE细胞增殖能力上升、凋亡明显下降,细胞周期G1期数目减少;3.BEL-7404/OXA-RBM8A-KD组细胞IC50值减少,肝细胞癌对OXA的耐受性显著降低,;MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE组细胞IC50值升高,肝细胞癌对OXA的耐受性显著提高;4.BEL-7404/OXA-RBM8A-KD细胞中ABCG2、ABCB1、ABCC1表达水平降低。MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE细胞中ABCG2、ABCB1、ABCC1表达水平升高;5.BEL-7404/OXA-RBM8A-KD组构建的裸鼠皮下移植瘤的生长速度、大小和体积均显著低于BEL-7404/OXA-RBM8A-NC组。结论:RBM8A在肝癌OXA耐药诱导过程中表达升高,过表达RBM8A促进体外亲本和耐药肝细胞癌的增殖,减少凋亡和细胞周期G1期细胞比例,诱导耐药蛋白表达升高,提高肝细胞癌对OXA耐受性,RBM8A参与肝细胞癌对OXA耐药的过程。第二章RBM8A介导EMT调控肝细胞癌对奥沙利铂耐药的机制研究目的:利用RBM8A沉默和过表达的OXA耐药肝细胞癌模型和裸鼠皮下移植瘤模型,检测RBM8A改变后细胞骨架、EMT特征和细胞迁移、侵袭能力的变化,探讨RBM8A通过EMT参与肝癌对OXA耐药的作用机制。方法:1.在RBM8A过表达和沉默的亲本肝细胞癌模型MHCC-97H-RBM8AOE、BEL-7404-RBM8A-KD以及OXA耐药肝细胞癌模型MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE、BEL-7404/OXA-RBM8A-KD中,运用细胞骨架染色检测各组细胞形态的变化;2.Western Blot和细胞免疫荧光法检测细胞内EMT相关因子Ecadherin,N-cadherin和Snail的表达;3.划痕法和Transwell检测细胞迁移和侵袭能力的变化;4.在裸鼠皮下耐药移植瘤模型中,免疫组化和Western Blot法检测瘤体组织的EMT相关因子E-cadherin,N-cadherin和Snail和耐药相关蛋白ABCG2、ABCB1、ABCC1的表达。结果:1.细胞骨架染色结果显示BEL-7404/OXA-RBM8A-KD组细胞骨架同样更倾向于圆形、少伪足的上皮形态;MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE组细胞骨架更倾向于梭形的间质形态。2.Western Blot和细胞荧光检测结果显示BEL-7404/OXA-RBM8A-KD中E-cadherin的表达水平显著升高,N-cadherin、snail的表达水平显著降低;MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE中E-cadherin的表达水平显著降低,N-cadherin、snail的表达水平显著升高。3.BEL-7404/OXA-RBM8A-KD细胞迁移、侵袭能力下降;MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE迁移、侵袭能力增强。4.BEL-7404/OXA-RBM8A-KD组构建的裸鼠皮下移植瘤瘤体中Ecadherin的表达水平显著高于BEL-7404/OXA-RBM8A-NC组,N-cadherin、snail的表达水平显著低于BEL-7404/OXA-RBM8A-NC组;多药耐药蛋白ABCG2、ABCB1、ABCC1的表达水平显著低于BEL-7404/OXA-RBM8ANC组。结论:过表达RBM8A诱导亲本和OXA耐药肝细胞癌骨架呈现间质样细胞表型,抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达,促进间质细胞标志物Ncadherin和Snail的表达,增强细胞迁移和侵袭能力,RBM8A能够通过诱导EMT参与肝细胞癌对OXA耐药的形成过程。第三章基于高通量芯片和生物信息学方法筛选RBM8A调控肝细胞癌对奥沙利铂耐药的分子机制研究目的:通过高通量芯片技术和生物信息学方法,分析RBM8A沉默和过表达的OXA耐药肝细胞癌模型中差异表达基因网络,并结合体外验证实验筛选潜在的调控因子和信号通路,探讨RBM8A在肝癌耐药中的分子网络。方法:1.在RBM8A过表达和沉默的OXA耐药肝细胞癌模型MHCC-97H/OXA-RBM8A-OE、BEL-7404/OXA-RBM8A-KD中,利用高通量芯片技术筛选耐药细胞中RBM8A表达改变前后的差异表达基因;2.通过加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis,WGCNA)分析差异表达基因并聚类成具有共表达现象的基因模块;3.通过富集分析和超几何分析寻找潜在的调控因子和信号通路,q RTPCR和Western Blot法在体外各组肝细胞癌验证差异基因和调控因子的表达水平。结果:1.韦恩图显示BEL-7404/OXA-RBM8A-NC VS.BEL-7404/OXARBM8A-KD和MHCC-97H/OXA-RBM8A-NC VS.MHCC-97H/OXARBM8A-OE两大组差异基因交集的结果,得到8365个相同的差异基因,q RT-PCR和Western Blot法验证IGF1、MAPK4和S100A1是其中显著的差异表达基因。2.WGCNA鉴定差异基因呈现出显著的共表达现象,并聚类成5个模块系统。3.GO功能和KEGG通路富集分析,得到18672个生物学进程,2639个细胞组成,3932个分子功能和943个KEGG通路。其中KEGG通路主要包括细胞粘附分子,细胞周期,乙型和丙型肝炎,病毒致癌,肌动蛋白细胞骨架的调控,RNA降解和转运,m RNA监视通路,RIG-I样受体信号通路,Erb B信号通路,胰岛素信号通路,MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路。4.超几何分析结合q RT-PCR和Western Blot法验证显示Lnc RNA MALAT1、Lnc RNA FENDRR、STAT3和HDAC9是潜在的核心调节因子。结论:RBM8A在肝细胞癌对OXA耐药过程中具有广泛的转录调控作用,RBM8A可能通过Lnc RNA MALAT1、Lnc RNA FENDRR、STAT3和HDAC9等关键调节因子以及胰岛素信号通路,MAPK信号通路和PI3KAkt信号通路等诱导EMT,从而参与肝细胞癌对OXA耐药的过程。