论文部分内容阅读
鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种对鸡危害极为严重的全球性寄生虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前对该病的防治主要以化学合成药及抗生素为主,由于长期应用易使鸡群产生抗药性,且在禽类产品中因有药物残留而影响人类健康。这使研究者将目标转移到了疫苗的研制方面,用分子生物学方法来预防球虫病具有潜在的优越性。本试验以鸡堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina, E.acervulina)为研究对象,构建了针对第二代裂殖子表面抗原3-1E基因的重组表达质粒pcDNA3.1-3-1E,并用该重组质粒作为DNA疫苗进行了免疫试验,为研制高效、安全的抗球虫疫苗和新药物奠定了基础。参考GenBank中收录的E.acervulina美国株(US株)裂殖子3-1E基因序列,设计特异性引物,以保定株堆型艾美耳球虫裂殖子RNA为模板,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增3-1E基因,经检测扩增产物为689bp。将扩增的3-1E基因克隆至PGM-T Easy载体,转化于感受态细胞Top10,蓝白斑法筛选出阳性重组子,提取阳性质粒DNA并测序。序列分析结果表明,该株的3-1E基因序列与参考序列(US株)同源性达99.6%,表明其具有很高的保守性。以克隆质粒PGM-3-1E为模板,扩增3-1E基因阅读框。将扩增产物与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组质粒pET28a-3-1E,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定,结果表明表达出的重组蛋白分子量大小约为22kDa;经Western blot鉴定结果表明该重组蛋白可被抗堆型艾美耳球虫的多克隆抗体识别,说明其具有很好的反应原性。将扩增的3-1E基因阅读框插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA-3-1E,pcDNA-3-1E经酶切和PCR鉴定均为阳性,测序分析为正向插入。用碱裂解法大量提取重组表达质粒,纯化后作为核酸疫苗接种一周龄雏鸡。分别设高(100μg)、中(50μg)、低(25μg)三个剂量组,同时设3-1E重组蛋白免疫组、活卵囊接种组、非免疫感染组和健康对照组。在7日龄时首免,14日龄加强免疫,一周后用2.5×105个E.acervulina BD株球虫孢子化卵囊进行攻毒试验。结果显示50μg的剂量可使试验鸡产生较强的抗虫效果:攻虫后鸡的卵囊产量下降67.67%,肠道病变记分降低66.96%,并使鸡的相对增重率达88.36%,ACI值为167.06。将纯化后重组表达质粒pcDNA3-3-1E 50μg注射7日龄雏鸡,一周后加强免疫,21日龄时取注射部位和非注射部位肌肉组织,采用RT-PCR方法检测目的基因。结果显示在注射部位扩增到了与插入基因大小一致的核苷酸序列,充分表明核酸疫苗可在鸡体内获得表达。