金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是一种常见的革兰氏阳性病原菌,致病性强,可以引起软组织感染、心内膜炎、肺炎和骨髓炎等多种疾病。近年来多种耐药金葡菌的出现和传播以及抗菌药物发现的滞后使细菌感染的临床治疗变得越来越困难,迫切需要研究新的抗菌策略来对抗日益严重的耐药菌感染。金葡菌的致病性主要取决于其在感染各个阶段所产生的毒力因子,而这些毒力因子并不是细菌生长所必需的,因此,通过抑制细菌的毒力因子可以有效降低金葡菌的致病性,而且不影响细菌本身的生长,减少耐药性的发生。血管性血友病因子结合蛋白(von Willebrand factor-binding protein,vWbp)是金葡菌分泌的一种凝固酶,作为影响金葡菌致病性的重要毒力因子,vWbp可以与血液中的凝血酶原结合形成活性的凝血酶,从而诱导纤维蛋白的生成,不但可以诱导凝血还可以减少粒细胞的活化和吞噬作用,促进细菌的存活。因此,开发针对vWbp的抗毒力药物可能是应对金葡菌相关感染的一种有前景的治疗方法。高良姜素是黄酮类化合物的一种,具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老等多种药理活性,还具有抗病毒和抗菌活性,但其是否可以通过抑制毒力因子vWbp治疗金葡菌引起的感染仍不得而知。实验目的:本实验以金葡菌的毒力因子vWbp为研究靶点,从不同中药单体中筛选出vWbp的抑制剂即高良姜素,研究高良姜素对vWbp的抑制作用以及作用机制,并通过构建小鼠金葡菌肺炎模型研究高良姜素在体内的实际治疗效果,为进一步开发可以治疗金葡菌感染的药物提供新的理论依据。实验方法:1.通过实验室现有载体vWbp-pET15b诱导表达vWbp蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析将蛋白质进行分离纯化。2.以纯化后的蛋白质为研究对象,通过试管凝血实验从不同中药单体中筛选出金葡菌vWbp的抑制剂。3.通过生长曲线实验和Western Blot实验研究高良姜素对金葡菌Newman生长以及vWbp蛋白表达量的影响。4.通过试管凝血实验和琼脂糖血平板实验研究不同浓度高良姜素对vWbp蛋白凝血活性的抑制作用。5.通过热漂移检测实验和生物膜层干涉实验研究高良姜素与vWbp蛋白是否为特异性结合。6.通过分子对接和分子动力学实验模拟高良姜素与vWbp蛋白的结合模式,并通过氨基酸点突变实验结合荧光淬灭和试管凝血实验推测vWbp蛋白与高良姜素结合的关键位点。7.构建小鼠金葡菌肺炎模型,通过生存率曲线、肺部菌落数的计算以及肺部病理学变化研究高良姜素对小鼠金葡菌肺炎的实际治疗效果。实验结果:1.经过SDS-PAGE鉴定,成功诱导表达出vWbp蛋白,大小为66 kDa,经过Ni-NTA亲和层析后得到纯度较高的vWbp蛋白。2.试管凝血实验表明,高良姜素可以明显抑制vWbp的凝血活性,延长凝血时间。3.生长曲线分析和Western Blot实验结果显示一定浓度的高良姜素对金葡菌Newman的生长和vWbp蛋白的表达没有影响。4.试管凝血法和琼脂糖血平板实验发现,高良姜素对vWbp蛋白凝血活性有明显的抑制作用,且随着浓度增高,抑制作用增强。5.热漂移检测实验证明高良姜素可以提高vWbp蛋白的热稳定性,表明两者为特异性结合;生物膜层干涉实验结果显示,结合了vWbp蛋白质的生物传感器与高良姜素作用后膜层厚度发生了变化,证明两者可以牢固结合。6.分子对接与动力学模拟实验以及点突变验证实验表明vWbp蛋白中的Trp-64和Leu-69残基可能是高良姜素与vWbp结合的关键位点。7.体内实验表明,经过高良姜素治疗后,感染金葡菌小鼠的生存率显著提高,肺部菌落数明显降低,且肺组织的病理改变减轻,表明高良姜素对小鼠金葡菌肺炎具有良好的治疗作用。实验结论:1.成功筛选出中药单体高良姜素在不抑制金葡菌Newman生长的情况下,对vWbp蛋白的凝血活性有明显的抑制作用,且呈剂量依赖性。2.高良姜素作为金葡菌vWbp的有效抑制剂,可以与vWbp牢固结合。3.vWbp蛋白中的Trp-64和Leu-69残基可能是高良姜素与vWbp结合的关键位点。4.高良姜素可以通过抑制vWbp的活性降低金葡菌的毒力,对小鼠金葡菌肺炎具有良好的治疗效果。