论文部分内容阅读
目前油菜(Brassica napus L.)的全基因组测序已经完成,油菜正式进入后基因组时代,基因功能的验证需要大量的突变体材料。通过构建油菜突变体库,可以加快油菜新突变体的发现。在本研究中,我们通过浸花法将pCB260-Kan质粒大规模转化甘蓝型油菜,然后通过Kan水溶液筛选和PCR鉴定,建立了甘蓝型油菜激活标签插入突变体库,从中挑选到了蜡质缺失突变体(wad),并进行了详细的表型分析和转录组分析。本研究的主要结果如下:1.突变体库的初建及通过Kan初步筛选转化株实验室先前利用除草剂对转化株进行筛选,但后期发现植株在移栽过程中很容易死亡。在本部分,我们将pCB260载体上的除草剂抗性基因替换成Kan抗性基因,并通过浸花法将pCB260-Kan质粒大规模转化甘蓝型油菜。然后我们建立了适用于甘蓝型油菜的筛选方法,相较于喷洒除草剂筛选,通过Kan溶液浸泡种子筛选,更加便于控制,对每株转化株的选择压力更加均匀。在通过Kan溶液初步筛选后,我们平均每500粒种子便得到了8-9棵苗,Kan筛选的阳性率在1.6%-1.8%之间。2.转化株的鉴定我们通过PCR对Kan筛选后的转化株做了进一步鉴定,发现大部分Kan筛选出的转化株为阳性植株,证明激活标签确实插入到了油菜基因组内。从中挑选了一株蜡质缺失突变体wad进行标签旁侧序列的克隆,然而我们尝试了很多次TAIL-PCR均没有得到插入标签的旁侧序列。3.蜡质缺失突变体wad的表型鉴定wad的叶片在幼苗时光亮,在成熟后恢复正常。通过甲苯胺蓝染色和叶绿素渗出实验,发现wad叶表面角质层不存在明显缺陷,通过扫描电镜观察证实wad确实是一株蜡质缺失突变体。通过气相色谱仪(GC)对wad蜡质组分进行了测定,发现在wad中C26和C28醛类、C27、C29和C31烷烃类以及C26、C28和C30伯醇类显著减少,这些碳链长度>C24的蜡质全部减少可能是脂肪酸延伸途径受阻引起的。为此我们测定了wad的叶片中脂肪酸含量,发现wad中大于C24的脂肪酸出现了明显的减少,证明了wad的蜡质缺失是由脂肪酸延伸受阻引起的。4.wad突变体的转录组分析对幼苗期的wad(wad-y)和野生型植株(WT-y),成熟后的wad(wad-m)和野生型植株(WT-m)进行了转录组测序(y表示young,m表示mature)。对WT-y VS wad-y,wad-y VS wad-m,WT-y VS WT-m和WT-m VS wad-m中的差异基因(DEGs)进行KEGG富集分析,使我们确定脂肪酸延伸途径与wad蜡质动态变化有着紧密的联系。随后对脂肪酸延伸途径的基因的表达模式进行分析,发现这些基因的表达水平在wad-y中降低,在wad-m中恢复正常,证明这些基因的表达水平与蜡质动态变化相关。对这些基因进行转录因子富集分析发现,这些基因都受到转录因子BASIC PENTACYSTEINE 6(BPC6)调控。总之,我们为研究油菜基因功能提供了大量的突变体材料。在突变体库中我们发现了一株在特定时期展现出蜡质恢复的蜡质缺失突变体,该突变体对于研究不同生长发育时期的蜡质调控有着重要的价值。此外,我们发现BPC6可能通过调控脂肪酸延伸影响蜡质的合成,这为研究甘蓝型油菜如何在不同时期调控蜡质提供了新的视角。