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第一部分MRSP通过PI3K-Akt通路促进血管平滑肌细胞凋亡目的:前期研究表明Mfn2基因具有显著的抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,我们在此基础上合成的Mfn2基因相关多肽(MRSP)的作用,尚缺乏具体的机制研究,本研究旨在明确MRSP干预对血管平滑肌细胞(VSMCs)凋亡的作用,并研究MRSP对VSMCs凋亡作用的机制研究。方法:分别采用不同浓度(10μM、25μM、50μM)的MRSP干预VSMCs,采用细胞计数法、Cell Death ELISA方法和TUNEL荧光染色的方法观察不同浓度MRSP对VSMCs凋亡的影响;Western Blot方法分析了各组对凋亡相关蛋白cleaved caspase8、cleaved caspase9、cleaved caspase3、Bax、Bcl2、细胞色素 c 等的表达水平,确认凋亡途径,并检测了相关信号通路PI3K-Akt的蛋白表达水平;随后,采用PI3K分子的激活剂740 Y-P和通路抑制剂LY294002验证PI3K/Akt信号通路的调节作用。结果:细胞计数与细胞凋亡ELISA结果显示,与对照组相比,MRSP在10~50μM范围内明显使细胞凋亡程度增加,其效应成时间和剂量依赖性;TUNEL结果显示,在12h时,MRSP在25 μM浓度即有明显影响,MRSP在100μM浓度时,有部分细胞出现细胞核消失;24h结果表明,MRSP在10~100μM均产生明显凋亡,50μM时部分细胞的细胞核消失,在100μM浓度时,消失明显。WB结果显示,caspase9激活明显,并呈剂量依赖性,caspase8没有明显的激活效应,cleavedcaspase3表达显著升高,Bax/Bcl2比值增加,MRSP干预增加了细胞色素c从线粒体释放至胞质中。MRSP抑制了 Akt的作用,因为其在Akt Ser473位点的磷酸化被MRSP抑制,呈浓度依赖性。用PI3K的激活剂740 Y-P和特异性抑制剂LY294002进行作用,发现提前用740 Y-P干预后,不仅很大部分解除了 MRSP诱导的Akt磷酸化的抑制,也阻止了 caspase-3的激活和VSMC凋亡(TUNEL图示)。采用LY294002提前干预后,LY294002及MRSP共同干预的效应比MRSP单独介导的Akt磷酸化的抑制作用强。以上结果提示MRSP引起细胞凋亡可能主要是通过线粒体凋亡途径介导。结论:本部分实验结果明确了 MRSP对VSMCs凋亡的影响,并进一步研究了凋亡的相关机制。结果提示MRSP诱导的VSMCs凋亡主要依赖于PI3K-Akt途径的抑制,进而激活线粒体凋亡信号级联通路。第二部分MRSP抗大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄作用与机制研究目的:研究MRSP在动物模型大鼠颈动脉球囊损伤中的效应,并验证其凋亡信号通路的机制作用。方法:雄性SD大鼠随机被分为3组:Sham组、Model组、MRSP(10mg/只)组,建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,术后7天和14天分别取材,HE染色显示MRSP对颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响;TUNEL荧光染色检测颈动脉球囊损伤后新生内膜凋亡水平;通过免疫组化的方法,检测球囊损伤后颈动脉血管Bax、Bcl2的表达水平;此外,通过免疫组化的方法检测凋亡标记蛋白cleaved caspase3的表达水平;western blot方法检测血管损伤后颈动脉p-PI3K、p-Akt的表达水平的变化。结果:HE染色结果显示,球囊损伤后7天和14天,模型组颈动脉内膜增厚均较明显,且与模型组相比,MRSP组内膜增厚的程度明显降低,7天和14天的内膜面积明显降低,I/M比值明显下降(p<0.01);TUNEL染色显示,与模型组相比,MRSP能明显增加血管TUNEL阳性率,显著提高血管组织的凋亡指数(p<0.01);免疫组化结果显示,与模型组相比,MRSP组的Bax血管平均光密度值显著升高(p<0.01),而Bcl2的平均光密度值降低,且MRSP升高了 cleaved caspase3的表达(p<0.01);WB结果显示,与模型组相比,抑制PI3K及Akt的磷酸化水平(p<0.01)。结论:MRSP通过PI3K-Akt途径促进颈动脉球囊损伤后内膜细胞凋亡,抑制该信号通路,激活线粒体凋亡信号级联通路,使内膜增生减缓,降低RS发生率。第三部分MRSP对颈动脉球囊损伤后血管炎症反应的作用目的:分析MRSP干预对颈动脉球囊损伤后血管氧化应激及血管壁炎症反应产生的影响方法:雄性SD大鼠随机被分为3组:Sham组、Model组、MRSP(10mg/只)组,建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,术后14天取材。DHE荧光染色用来检测颈动脉球囊损伤后血管超氧阴离子的产生水平;采用血生化试剂盒检测损伤血管MDA、SOD、GSH的含量;采用ELISA试剂盒检测损伤血管炎症因子IL6、TNFα、IL-1β的浓度;Western blot方法检测颈动脉组织中炎症相关蛋白的表达水平。结果:DHE荧光染色结果显示,与模型组相比,MRSP组颈动脉DHE染色荧光强度明显降低(p<0.01);血生化结果显示,反映氧化应激程度的MDA在MRSP组的含量降低(p<0.01),MRSP处理显著提高了抗氧化指标SOD和GSH的浓度水平(p<0.01);ELISA结果显示MRSP处理明显降低了促炎因子IL6、TNFα、IL-1β的水平(p<0.01);WB结果显示,MRSP处理后,颈动脉中致炎因子IL6(p<0.01)、TNFα(p<0.01)、MCP1(p<0.05)等表达明显下降,且炎症相关信号分子NF-κB的活性降低(p<0.01)。结论:MRSP干预既明显升高了大鼠颈动脉中促ROS清除能力,又改善了血管中促炎反应,表明MRSP发挥抗RS作用与减少促炎细胞因子和减缓氧化应激均有关。