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【背景】帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是中老年常见的一种运动障碍疾病,病理变化为黑质多巴胺能神经元退行性变。越来越多的研究表明,线粒体功能障碍如线粒体质量控制、氧化应激、泛素化系统异常等机制,导致PD病理改变。近年来线粒体蛋白质量控制(PQC)异常,尤其是早期发生的线粒体未折叠蛋白反应(mtUPR)可能直接或间接地参与了PD发生和发展,而其机制尚不明确。【目的】1.观察不同时间点MPP~+诱导SH-SY5Y细胞mtUPR的变化。2.探讨PGC-1α过表达对SH-SY5Y细胞mtUPR的影响。3.探讨PGC-1α/LRPPRC信号转导对mtUPR的影响。【方法】1.根据前期摸索的最适腺病毒感染MOI值(100)和MPP~+工作浓度(1000umol/L)建立PD模型和过表达PGC-1α细胞模型。2.免疫印迹和Real-Time PCR方法检测MPP~+干预下SH-SY5Y细胞不同时间YME1L1、HSPA9、CLPP、HSPE1的表达水平。3.免疫印迹和Real-Time PCR方法检测各实验组PGC-1α、LRPPRC及蛋白酶YME1L1、CLPP和分子伴侣HSPA9、HSPE1的表达水平。4.荧光共聚焦显微镜观察LRPPRC在不同实验组核内外分布情况。【结果】1.通过免疫印迹和Real-Time PCR检测发现:SH-SY5Y细胞经MPP~+干预后与其他组相比,在24小时组蛋白酶YME1L1、CLPP及分子伴侣HSPA9、HSPE1蛋白及转录水平达到最高,实现了mtUPR的激活。2.荧光显微镜观察发现:空病毒和过表达PGC-1α腺病毒感染细胞,在MOI值为100时,细胞感染率大于90%,仅较少的细胞死亡,适合细胞感染。3.免疫印迹和Real-Time PCR方法显示:过表达PGC-1α组中,蛋白酶YME1L1、CLPP及分子伴侣HSPA9、HSPE1表达水平和转录水平比空病毒组和空白对照组均有明显的提高,说明了过表达PGC-1α激活了mtUPR,并对SH-SY5Y细胞具有保护作用。4.免疫印迹和Real-Time PCR显示:过表达PGC-1α组中,PGC-1α和LRPPRC蛋白水平和转录水平均有明显的一致性提高;荧光共聚焦结果显示:正常情况下,LRPPRC主要分布在细胞核、线粒体及细胞骨架内;MPP~+干预后,LRPPRC出现了微量地向细胞核外转移;过表达PGC-1α后,相对于经MPP~+处理组,LRPPRC在细胞核内有进一步的减少。说明PGC-1α过表达可能通过LRPPRC发挥线粒体保护效应。【结论】1.本实验通过MPP~+干预SH-SY5Y细胞建立建立帕金森病(PD)细胞模型,并且成功激活线粒体未折叠蛋白反应(mtUPR)。2.在MPP~+干预后24小时mtUPR蛋白酶YME1L1、CLPP及分子伴侣HSPA9、HSPE1表达水平达到最高,此时mtUPR发挥最大作用。3.PGC-1α表达增加,使参与mtUPR蛋白酶YME1L1、CLPP及分子伴侣HSPA9、HSPE1核转录因子增加,提示过表达PGC-1α可能通过激活mtUPR,减少MPP~+引起的氧化应激损伤。4.过表达PGC-1α后LRPPRC蛋白水平和转录水平均得到了提高,并与mtUPR蛋白酶及分子伴侣表达的趋势基本一致;荧光共聚焦观察发现MPP~+干预及过表达PGC-1α后,LRPPRC有向核外转移的趋势。我们推测PGC-1α可能通过LRPPRC信号转导激活mtUPR以维持线粒体稳态。