论文部分内容阅读
研究目的:胆道闭锁（Biliary atresia,BA）是一种多病因所致的新生儿严重肝胆疾病,以肝外胆管闭锁和肝内胆管进行性硬化为特征,发病机制尚未完全阐明。已知BA肝脏中存在血管结构改变和缺血征象,而肝动脉末端分支形成的胆管周围血管丛是胆管的唯一血供来源,鉴于Notch3信号通路对围产期血管发育至关重要,本研究拟从血管因素这一全新视角,探索Notch3信号通路与肝动脉结构改变如何影响BA发病的作用机制。研究方法:（1）肝动脉多普勒超声与术中吲哚菁绿血管造影评估BA患儿肝动脉血流灌注病理性黄疸患儿分为BA组与非BA胆汁淤积组（Non-BA cholestasis,Non-BA组）。超声测量肝动脉直径（Hepatic artery diameter,HAD）、门静脉直径（Portal Vein diameter,PVD）、肝动脉阻力指数（Hepatic artery resistance index,HARI）及肝动脉加速时间（Hepatic acceleration time,HAT）;术中吲哚菁绿（Indocyanine green,ICG）血管造影以评估肝动脉整体灌流情况。（2）BA患儿及动物模型肝包膜血管征观察选择年龄30d以内,肝纤维化病理分级在1或2级的BA患儿,集中观察验证较早期人群中的HSST征;新生BALB/c小鼠随机分为RRV组与阴性对照组（NC组）,轮状病毒（Rotavirus,RRV）或MEM培养基腹腔注射进行建模和对照,于正置显微镜下观察小鼠肝脏表面血管征。Day1记为RRV/MEM注射后第1d。（3）BA患儿及动物模型胆管周围肝动脉组织形态学观察分组设置:BA组,年龄匹配的Non-BA组与非淤胆性肝脏疾病组（Non-cholestasis control,Non-CC组）。通过HE染色及α-SMA免疫组化染色观察肝脏汇管区血管形态,测量分析肝微动脉管壁厚度（Arterial wall,AW）、管腔内径（Internal diameter,ID）及AW/ID值;HE染色及α-SMA/HIF-1α免疫组化染色用以动态观察小鼠肝动脉系统结构与汇管区缺氧情况,测量分析AW/ID值。（4）Notch家族及Notch3在BA患儿及动物模型肝脏中的表达分析RT-PCR检测BA组与Non-BA组肝脏组织中Notch1-4以及下游靶基因Hes1、Hes5、Hey1、Hey2、Hey L的表达,Western-blot检测验证Notch3-hey1蛋白表达。OPAL多光谱染色标记HIF-1α、Notch3、CK19、SMMHC与Vimentin抗体,原位类流式定量分析阳性细胞数;在小鼠肝脏中重复检测Notch1-4以及Notch3、HIF-1α、VEGFA的动态表达趋势。（5）BA肝动脉平滑肌细胞（hepatic arterial smooth muscle cells,HASMCs）表型及增殖活性分析SMMHC与Vimentin抗体分别标记收缩型与合成型HASMCs,对比分析二者在OPAL染色中的结果;提取RRV组与NC组小鼠肝门部血管SMCs培养,以α-SMA与Vimentin荧光染色强度对比细胞亚型,EDU染色评估其增殖状态。（6）NICD3过表达腺病毒构建及动物模型干预过表达基因工具为搭载Notch3胞内活性结构域NICD3的腺病毒（Ade-NICD3）,空载腺病毒Ade-Null作为对照。单一过表达NICD3,分为Ade-NICD3组和Ade-Null组;在BA小鼠中过表达NICD3,设置MEM+Ade-Null组、RRV+Ade-Null组和RRV+Ade-NICD3组,记录小鼠一般生长情况、生存率、肝包膜血管征,对比炎症因子Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5、IL-6、TNF-α以及HIF-1α的动态表达趋势。（7）中和抗体/DAPT抑制BA动物模型中Notch3信号活化Notch3中和抗体及Notch广谱抑制剂DAPT下调干预。抗体实验分为RRV+Notch3-Ab组、MEM+PBS组和RRV+PBS组。RT-PCR检测Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5、IL-6与TNF-α表达,流式细胞术检测DC和NK细胞,观察小鼠一般生长情况、生存率、肝包膜血管征和BA表型。DAPT干预实验分为DMSO+MEM组、DAPT+RRV组、DMSO+RRV组。对比观察小鼠一般生长情况、生存率、肝包膜血管征和BA表型。（8）BALB/c Notch3-/-基因敲除鼠RRV造模在BALB/c Notch3-/-小鼠中进行最终验证,按常规RRV腹腔注射方式进行造模,野生（WT）BALB/c小鼠作为对照,记录小鼠一般生长情况、生存率、肝包膜血管征和BA表型。研究结果:（1）BA患儿及小鼠模型中均存在肝动脉结构重塑现象BA患儿汇管区的肝微动脉AW/ID比值显著高于Non-BA组和Non-CC组,HAD与PVD较Non-BA组均明显增宽,HARI显著增加。ICG血管造影发现,Non-BA肝脏均在ICG推注5s后出现高强度荧光,BA患儿中则存在两种截然不同的现象:约1/3表现为数s内迅速“点亮”,而约2/3BA肝脏在ICG推注2min后方达到同等荧光强度,提示肝动脉血流灌注缓慢。小鼠汇管区见单层平滑肌或内皮细胞组成的小血管与小胆管结构,均在RRV感染后Day3快速破坏,门静脉周围被免疫细胞填充。汇管区HIF-1α随着病程进展逐渐增加。NC组小鼠Day10时肝门部可见大血管与胆管结构,而同日龄的RRV组仅见小胆管和管腔相对狭窄的肝动脉,AW/ID值增加。（2）异常肝包膜表面血管丛出现在未表现显著纤维化的BA患儿和小鼠模型中本中心收治的12例小龄BA患儿尚未进展至3级肝纤维化,但均在腹腔镜下观察到典型HSST征。9/12只小鼠在Day1417肝脏膈面和脏面包膜上镜下可见异常血管征,而NC组小鼠肝包膜表面无小血管丛生长。（3）BA患儿及小鼠模型肝动脉系统Notch3异常活化与平滑肌细胞表型失衡人类肝脏Notch3在BA组表达显著高于Non-CC组和Non-BA组,下游主要靶基因为Hey1。Notch3表达定位于肝动脉系统,处于缺氧状态的胆管上皮细胞以及合成型SMCs较Non-BA组均增多。RRV组小鼠肝脏Notch3 m RNA较NC组均呈显著高表达,Day7时呈现表达高峰,Day10仍维持在较高水平,而VEGF升高反应相对滞后。HIF-1α在病程中后期积累增高。RRV组血管SMCs较NC组形成细胞突起较少,形态偏幼稚,其表型更偏向合成型,较NC组增殖更活跃。（4）在RRV诱导的小鼠模型中早期过表达Notch3加速BA病程进展正常小鼠早期过表达Notch3时肝包膜表面血管征出现。Ade-NICD3组小鼠较Ade-Null组出现远期体重增长停滞,肝脏HIF-1α与IL-6、Cxcl2、Cxcl5出现远期增高趋势。RRV+Ade-NICD3组小鼠则表现出病程进展加速:生长发育落后,小鼠体型小、覆毛差,在Day12内全部死亡。RRV+Ade-NICD3组Day7时肝门部胆囊硬化,肝包膜上广泛分布出血点,少量血管丛生长。汇管区胆周小血管快速失去正常结构,SMCs紊乱增生呈网状。RRV+Ade-NICD3组肝脏IL-6、Cxcl1、Cxcl2和TNF-αm RNA在Day7即超过RRV+PBS组,升高速度加快。（5）阻断野生小鼠（WT）Notch3受体及Notch3基因敲除（Notch3-/-）对RRV感染表现出保护作用Notch3-Ab早期干预对WT RRV小鼠表现出保护作用,Day14时肝外胆管通畅,未见异常肝包膜血管丛,汇管区HIF-1α表达减少,后期可见部分小胆管和小血管正常结构恢复;炎症因子从Day3到Day7表现出上升趋势,但在Day7后维持或转而下降,Day10时IL-6、Cxcl1、Cxcl2和TNF-α显著低于RRV对照组,肝脏中DC和NK细胞数减少。DAPT对WT小鼠保护作用有限,可延长生存时间,但未能阻止BA表型形成,镜下可见肝包膜血管征形成。BALB/c Notch3-/-小鼠进行RRV造模,小鼠生存率提高,未见肝包膜血管征形成,BA表型好转。研究结论:Notch3信号通路介导肝动脉系统重塑与异常肝包膜血管征形成。肝动脉结构病变可能导致肝内汇管区与肝外胆管微环境供血障碍,从而成为BA发病和病程进展中的潜在协同作用因素。