杜鹃属植物内生真菌的分离鉴定及其抗中药材害虫活性研究

来源 :西北师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chaizw
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目前,中药材种植和仓储过程中出现的病虫害问题,使得中药材的药用价值和商品价值大幅降低或丧失。当前针对中药材种植和仓储害虫,多采用剧毒、高毒的化学药剂进行防治。开发环保、高效的新型杀虫药物,对中药材种植及仓储害虫的绿色防控具有重要意义。植物内生真菌不仅种类丰富,可代谢产生结构多样的化合物,并且可能代谢产生结构新颖的化合物,是新天然活性产物的重要来源,也是无公害新型农药的宝贵资源。本研究在前期筛选中,发现杜鹃属植物对赤拟谷盗和马铃薯茎线虫具有良好的生物活性。为此本文选用4种杜鹃属植物进行内生真菌的分离纯化,并研究其代谢产物对赤拟谷盗和马铃薯茎线虫的防治作用,以期获得活性菌株,并进行化学成分研究,探索其防治害虫的物质基础,为发展中药材生态种植和绿色仓储进行基础研究。具体研究内容及实验结果如下:1、植物内生真菌分离:通过组织切块法和平板划线法,对千里香杜鹃(Rhododendron thymifolium)、头花杜鹃(R.capitatum)、烈香杜鹃(R.anthopogonoide)、陇蜀杜鹃(R.przewalskii)这四种植物不同组织进行内生真菌的分离,共获得22株内生真菌,分别为:千里香杜鹃5株,头花杜鹃7株,烈香杜鹃3株,陇蜀杜鹃7株。其中从枝、叶中分别得到13、9株内生真菌,分别占分离菌株总数的59.09%和40.91%。2、菌株活性筛选:采用PDB培养基液体发酵技术、甲醇回流提取等方法,对22株内生真菌及其次级代谢产物进行粗提物的制备,共得到44个粗提物。通过测定44种粗提物对赤拟谷盗触杀、拒食以及对马铃薯茎线虫的杀灭活性,结果表明,LS-Y-1菌丝体粗提物对赤拟谷盗的触杀活性最好,其LD50为69.31μg/adult,而LS-Y-1菌液粗提物在赤拟谷盗拒食(FDI=84.28%)和马铃薯茎线虫杀灭(LC50=0.06 mg/m L)方面的活性明显。其次是菌株TH-Z-1菌液粗提物对马铃薯茎线虫(LC50=0.07 mg/m L)有明显的杀灭活性;菌株LS-Y-4菌液粗提物和菌丝体粗提物分别对赤拟谷盗拒食(FDI=73.12%)和马铃薯茎线虫杀灭作用(LC50=0.18mg/m L)效果明显。综合以上结果,在多个活性筛选试验中,发现菌株LS-Y-1、LS-Y-4、TH-Z-1具有良好的生物活性。3、活性菌株鉴定:通过分子生物学鉴定及形态学分析对筛选出的活性较高的3株内生真菌进行了菌种鉴定。菌株LS-Y-1和LS-Y-4与链格孢属(Alternaria sp.)真菌菌种相似度较高,链格孢属(Alternaria sp.)属于丛梗孢目,在植物的内生真菌中普遍存在。菌株TH-Z-1则与栓菌属(Trametes sp.)真菌菌种具有较高的相似性。4、化学成分分离与鉴定:经过前期的活性筛选,选取抗虫活性好且作用效果全面的菌株LS-Y-1进行化学成分初探。利用硅胶柱层析、凝胶柱色谱等多种色谱手段对内生真菌LS-Y-1及其次级代谢产物的化学成分进行化合物的分离纯化。最终获得6个化合物,利用1H-NMR、13C-NMR等波谱技术,对分离、纯化的化合物进行结构鉴定,最终确定出了其中5个化合物,分别是:2,4-二甲基十二烷-1-醇(1)、甘露醇(2)、4-O-β-D-吡喃半乳糖基-赤藓糖醇(3)、链格孢酚9-O-甲醚(4)、尿囊素(5)。其中化合物1:2,4-二甲基十二烷-1-醇是首次在链格孢属(Alternaria sp.)真菌中被分离出来。5、分离化合物的活性测定:通过对其中五种化合物进行活性测试,综合各实验结果发现,其中链格孢酚9-O-甲醚生物活性最好,不仅对赤拟谷盗成虫(LD50=38.26μg/adult)和幼虫(LD50=51.89μg/larvae)均具有明显的触杀活性,并且对马铃薯茎线虫(LC50=0.56 mg/m L)也有显著的杀灭活性。其次是2,4-二甲基十二烷-1-醇,对赤拟谷盗成虫(LD50=43.43μg/adult)和马铃薯茎线虫(LC50=1.64mg/m L)均有明显的杀灭活性。在此基础上,选择甘露醇和链格孢酚9-O-甲醚以不同比例复配后,发现当两者体积比为6:2时,对赤拟谷盗成虫的触杀活性明显增强,表现为协同作用。综上所述,本论文通过分离纯化得到22株杜鹃属植物内生真菌,经过抗虫活性筛选获得1株活性内生真菌,通过分离鉴定得到内生真菌中5个化合物的结构,探究了这些化合物对中药材种植及仓储害虫的抗虫活性。综合实验结果,证明植物内生真菌在中药材害虫的绿色防治方面具有一定的研究价值。
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