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背景和目的:急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)以是一种由多病因引起的,以肾功能迅速下降为特征的临床综合征。引起AKI的原因包括药物毒性,缺血再灌注,脓毒血症等。AKI是住院患者最常见的并发症之一,其发病率日益增加,尤其在老年人中具有高发病率和高死亡率,尽管有一定比例AKI患者肾脏会发生自我修复过程,但严重或反复发生的AKI仍可能转变为慢性肾脏病(CKD)甚至终末期肾脏病。由于目前AKI的治疗仅包括对症支持治疗和肾脏替代治疗,仍缺乏有效的治疗药物和关键靶点,因此寻找AKI的治疗药物具有重要意义。传统中药(TCMs)是以传统中医药理论作为指导,拥有独特的应用形式和理论体系,被用于疾病的防治以及具有保健作用的天然药物或其加工替代品,主要包括植物药、矿物药、动物药等等。由于它具有较低毒副作用的特点,近年来越来越多的研究尝试将中药运用于临床疾病的治疗,而青蒿素在疟疾治疗中的成功应用更证实了天然化合物的潜在价值。本课题组前期通过构建体外和体内AKI模型,初步鉴定出一系列具有抗炎、抗细胞死亡作用的中药单体及其衍生物包括汉黄芩素、葛根素、淫羊藿苷、原儿茶醛、吴茱萸次碱等。前期研究结果显示,从传统中药吴茱萸中提取出的化学单体吴茱萸次碱(Ru)对肾小管上皮细胞损伤具有良好的保护作用。我们通过对吴茱萸次碱的结构改造,增加其选择性,降低其副作用,获得了一系列3-芳香族磺酰胺取代的吴茱萸次碱衍生物。本课题进一步探究吴茱萸次碱衍生物对顺铂诱导的急性肾损伤的保护功能及其作用机制,为急性肾损伤寻找潜在的治疗靶点和新的思路。方法:体外实验:选取第6至15代之间的人肾小管上皮细胞(HK2)用于实验。首先通过MTT筛选药物最适治疗浓度。该实验分为六组:正常对照组,单独给药组,顺铂模型组,低剂量给药组,中剂量给药组,高剂量给药组。提取细胞蛋白和m RNA,通过Western blot,免疫荧光,Real-time PCR检测肾脏损伤因子1(KIM-1)表达,采用Western blot,Real-time PCR检测肾脏炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的释放,炎症通路关键蛋白NF-kB-P65的磷酸化,运用Western blot检测程序性坏死关键蛋白RIPK1/RIPK3/MLKL的表达,凋亡金指标Cleaved-Caspase3的变化,流式细胞术检测细胞凋亡水平。最后运用Western blot检测氧化应激NOX家族重要成员NOX1,NOX2,NOX4的表达,DCF、DHE检测细胞内氧化应激水平。运用公共预测网站DS2017进行药物靶点预测,采取分子对接、CESTA实验验证药物与靶点PDE4B的结合。运用Western blot,免疫荧光检测靶蛋白PDE4B的表达。通过si RNA转染沉默PDE4B表达,运用Western blot,Real-time PCR检测PDE4B沉默后,吴茱萸次碱衍生物对肾小管上皮细胞炎症反应,细胞程序性死亡的影响。采用PDE4抑制剂咯利普兰(Rolipram)作为阳性对照组,运用Western blot,Real-time PCR检测药物选择性抑制PDE4B是否具有更好的保护作用。体内实验:通过小鼠腹腔注射顺铂(20 mg/kg)构建急性肾损伤模型,分别给予吴茱萸次碱四号衍生物Ru-4(25,50,和100 mg/kg)治疗。该实验分为六组(n=8):正常对照组,单独给药组,顺铂模型组,低剂量给药组,中剂量给药组,高剂量给药组,吴茱萸次碱母核给药组。造模成功后,通过血肌酐和尿素氮检测观察各组小鼠肾功能变化,运用PAS染色对比各组肾小管形态学改变,通过Western blot,免疫组化,Real-time PCR检测肾脏损伤因子1(KIM-1)表达。同样采用Western blot,免疫组化,Real-time PCR检测肾脏炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的m RNA表达水平,炎症通路关键蛋白NF-kB-P65的磷酸化,以及药物靶蛋白PDE4B的表达变化。最后运用Western blot检测程序性坏死关键蛋白RIPK1/RIPK3/MLKL的表达,凋亡金指标Cleaved Caspase3的变化以及氧化应激NOX家族重要成员NOX1,NOX2,NOX4的表达。结果:体外实验:MTT显示,在吴茱萸次碱系列衍生物中,Ru-4和Ru-7具有最好的细胞保护作用。同时Western blot结果表明Ru-4具有比吴茱萸次碱母核以及Ru-7更好的减轻肾小管上皮细胞损伤的作用。免疫荧光,Real-time PCR同样证实Ru-4可以减轻KIM-1的表达。Western blot,Real-time PCR也表明Ru-4可以减轻炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的释放以及NF-kB-P65的磷酸化。此外,流式细胞术显示在经过Ru-4治疗后,细胞凋亡水平明显减轻,Western blot同样表明程序性坏死关键蛋白RIPK1/RIPK3/MLKL以及凋亡金指标Cleaved Caspase3的减少。最后DCF染色、DHE染色以及Western blot也证实了Ru-4可以减轻氧化应激的发生。通过分子生物学预测,分子对接以及细胞热位移实验(CESTA)均证实了磷酸二酯酶4B(PDE4B)为Ru-4的可能作用靶点。Western blot、免疫荧光也表明Ru-4可以减轻PDE4B蛋白水平的表达,并增加c AMP的含量。同时我们在沉默PDE4B的细胞上,予以Ru-4治疗后,Western blot结果显示PDE4B沉默可以减轻肾小管上皮细胞损伤,但药物无法进一步逆转顺铂诱导的细胞损伤。同时Western blot也表明加入PDE4抑制剂咯利普兰(rolipram)干预后,靶向抑制PDE4B在顺铂处理后的肾小管上皮细胞中具有更好的保护作用。因此我们证明了Ru-4通过PDE4B依赖的途径发挥作用。体内实验:血清肌酐和尿素氮结果表明,Ru-4可以明显逆转顺铂诱导的肾功能减退。同样肾脏PAS染色显示药物减轻肾小管扩张。Western blot、免疫组化和Real-time PCR证实急性肾损伤标志蛋白肾损伤因子1(KIM-1)也有所减轻。同时我们也发现Ru-4可以缓解顺铂诱导的肾脏细胞程序性死亡、炎症反应以及氧化应激的发生。结论:(1)体外研究显示,Ru-4抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤、炎症反应、程序性死亡和氧化应激,并具有比传统PDE4抑制剂咯利普兰更好的细胞保护作用;(2)体外研究显示,经过公共预测网站、分子对接以及CESTA实验证明Ru-4可能通过靶向PDE4B发挥作用。在PDE4B沉默的细胞中,Ru-4不能进一步减轻顺铂诱导的HK2细胞损伤、炎症反应及程序性死亡,提示Ru-4可能通过PDE4B依赖性机制对顺铂诱导的HK2细胞损伤起保护作用;(3)体内实验显示,Ru-4有效抑制顺铂诱导的小鼠急性肾损伤导致的肾功能下降、细胞程序性死亡、炎症反应和氧化应激的发生,具有良好的应用前景;