第一部分研究神经病理性疼痛大鼠脊髓中P2Y12受体的表达情况及其对疼痛行为学的影响目的检测脊神经根结扎模型(SNL)神经病理性疼痛大鼠脊髓P2Y12受体蛋白的表达情况及其抑制剂对大鼠疼痛行为学的影响变化。方法(1)通过进行L5脊神经根结扎建立SNL神经病理性疼痛大鼠模型;(2)通过western blot法检测SNL模型大鼠术后脊髓P2Y12蛋白的表达时程变化情况;(3)通过共聚焦免疫荧光组织化学定量法检测SNL模型大鼠脊髓P2Y12蛋白表达时程变化情况;(4)通过共聚焦免疫荧光组织化学双标法检测SNL模型大鼠脊髓背角的P2Y12蛋白与神经元、小胶质细胞、星型胶质细胞以及少突胶质细胞的细胞共定位情况;(5)构建大鼠鞘内置管模型,以方便鞘内给药;(6)用von Frey纤维丝检测大鼠的机械痛阈变化情况,比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的机械痛阈变化情况;(7)用Hargreaves’热辐射刺激法检测大鼠的热痛阈变化情况,比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的热痛阈变化情况;(8)通过western blot法检测SNL模型大鼠鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395后脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达变化情况;(9)通过共聚焦免疫荧光组织化学定量法检测SNL模型大鼠鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395后脊髓的P2Y12蛋白,小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的荧光定量表达变化以及共定位情况。结果(1)L5脊神经根结扎术可建立稳定的SNL神经病理性疼痛大鼠模型,大鼠出现足底略外翻,足爪内收,足底不愿长时间着地的痛觉过敏现象;(2)Western blot结果显示,在术后第3天,第7天,第14天,SNL模型大鼠患侧脊髓的P2Y12蛋白表达量较假手术组显著上调;(3)共聚焦免疫荧光组织化学荧光定量结果显示,在术后第3天,第7天,SNL模型大鼠患侧脊髓的P2Y12蛋白表达量较假手术组显著上调;(4)共聚焦免疫荧光组织化学双标结果显示,SNL模型大鼠脊髓背角的P2Y12蛋白与小胶质细胞标记物明显共标、与神经元、星型胶质细胞以及少突胶质细胞无明显共标;(5)大鼠鞘内置管模型成功建立,少量利多卡因鞘内注射后能够引起可逆性双侧后肢麻痹;(6)Von Frey纤维丝观测大鼠机械痛阈值结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠的机械痛阈值明显降低;与SNL手术组相比,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的机械痛阈值明显上调;(7)Hargreaves’热辐射刺激法观测大鼠热痛阈值结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠的热痛阈值明显降低;与SNL手术组相比,SNL+鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395组,SNL+口服P2Y12抑制剂氯吡格雷组大鼠的热痛阈值明显上调;(8)Western blot结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠患侧脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白表达量明显增多;与SNL单纯手术组比较,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395或者口服P2Y12抑制剂氯吡格雷的SNL大鼠患侧脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白表达量明显较少;(9)共聚焦免疫荧光组织化学荧光定量结果显示,与假手术组相比,SNL手术组大鼠患侧脊髓背角的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达量显著增加,并且小胶质细胞形态呈现为阿米巴样的激活态;与SNL单纯手术组比较,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395后的SNL模型组大鼠患侧脊髓的小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达量显著减少,并且小胶质细胞的形态呈现为分支状的静息态。结论L5脊神经根结扎(SNL)大鼠的机械痛和热痛可以被P2Y12抑制剂部分逆转,同时P2Y12抑制剂可以抑制术后大鼠脊髓背角小胶质细胞激活标记物iba-1蛋白的表达。第二部分神经病理性疼痛大鼠脊髓中P2Y12受体与p38MAPK和Rho A/ROCK2信号通路蛋白表达的关系研究目的研究神经病理性疼痛大鼠患侧脊髓中P2Y12受体与Rho A/ROCK2和p38MAPK信号通路蛋白表达的时程与可能上下游关系。方法(1)通过进行L5脊神经根结扎建立SNL神经病理性疼痛大鼠模型;(2)通过共聚焦免疫荧光组织化学双标法观测SNL模型大鼠脊髓中的小胶质细胞激活标记物iba-1与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)各个信号通路分子(p38MAPK,p JNK,p ERK)的共定位情况;(3)通过western blot法观测SNL模型大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路分子蛋白的表达时程变化情况;(4)通过western blot法观测P2Y12抑制剂对SNL模型大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路分子蛋白的表达影响情况;(5)用von Frey纤维丝检测SNL术后大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路的抑制剂对其机械痛阈值的影响情况。比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂组的机械痛阈值变化;(6)用Hargreaves’热辐射刺激法检测SNL术后大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂对大鼠热痛阈值的影响变化情况。比较假手术组,SNL手术组,SNL+鞘内注射激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制剂组大鼠的热痛阈值变化情况;(7)通过western blot法检测SNL术后大鼠脊髓中Rho A/ROCK2信号通路蛋白的表达时程变化情况;(8)通过western blot法检测P2Y12抑制剂对SNL大鼠脊髓中Rho A/ROCK2信号通路分子蛋白的表达影响情况;(9)通过western blot法检测ROCK抑制剂对SNL大鼠脊髓中激活的丝裂原活化蛋白激酶信号通路分子蛋白的表达影响情况;(10)用von Frey纤维丝检测ROCK抑制剂对SNL术后大鼠机械痛阈值的影响变化情况。(11)用Hargreaves’热辐射刺激法检测ROCK抑制剂对SNL术后大鼠热痛阈值的影响变化情况。结果(1)共聚焦免疫荧光组织化学结果显示SNL模型大鼠患侧脊髓的丝裂原活化蛋白激酶主要通路之一的p38MAPK信号通路出现显著的激活情况,并与小胶质细胞激活标记物iba-1出现显著共标;(2)Western blot结果显示,SNL模型大鼠患侧脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达在术后第3天,第7天,第14天都明显高于假手术组;(3)Western blot结果显示,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395使SNL大鼠术后第7天患侧脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达量减少;(4)Von Frey纤维丝观测大鼠的机械痛阈值结果显示,鞘内注射p38MAPK抑制剂SB203580可以显著提高SNL大鼠的机械触诱发痛阈值;(5)Hargreaves’热辐射刺激法观测大鼠的热痛阈值结果显示,鞘内注射p38MAPK抑制剂SB203580可以显著上调SNL大鼠的热痛阈值;(6)Western blot结果显示,SNL模型大鼠患侧脊髓GTP-Rho A和ROCK2蛋白在术后第3天,第7天,第14天的表达量显著增加;(7)Western blot结果显示,鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395可以显著下调SNL大鼠术后第7天患侧脊髓中ROCK2蛋白的表达量;(8)Western blot结果显示,鞘内注射ROCK抑制剂Y27632可以显著下调使SNL大鼠术后第7天患侧脊髓中磷酸化p38MAPK蛋白的表达量;(9)Von Frey纤维丝观测大鼠的机械痛阈值结果显示,ROCK抑制剂Y27632可以显著上调SNL大鼠的机械触诱发痛阈值;(10)Hargreaves’热辐射刺激法观测大鼠的热痛阈值结果显示,ROCK抑制剂Y27632可以显著上调SNL大鼠的热痛阈值。结论Rho A/ROCK2和p38MAPK信号通路在L5脊神经根结扎模型(SNL)神经病理性疼痛大鼠的患侧脊髓中都有显著激活,而鞘内注射P2Y12抑制剂MRS2395可以抑制此两条信号通路的激活;其中,ROCK抑制剂Y27632可以抑制p38MAPK信号通路的激活,而p38MAPK抑制剂SB203580不影响ROCK信号通路,因此我们大胆推测Rho A/ROCK2是p38MAPK的上游信号通路;p38MAPK抑制剂SB203580或者ROCK抑制剂Y27632鞘内注射都可以缓解SNL大鼠的机械触诱发痛和热痛觉过敏现象。第三部分P2Y12基因敲除对神经病理性疼痛小鼠疼痛行为学及其脊髓背角Ⅱ层神经元兴奋性突触传递的影响目的研究P2Y12基因敲除小鼠进行部分坐骨神经结扎(PSNL)手术后的疼痛行为学变化以及脊髓背角Ⅱ层神经元兴奋性突触传递的电生理变化情况。方法(1)PCR鉴定小鼠基因型,选取出野生型纯合子和P2Y12基因敲除纯合子进行实验,杂合子继续饲养生育;(2)通过结扎部分坐骨神经建立稳定的PSNL神经病理性疼痛小鼠模型,随机分为野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组;(3)用1g von Frey纤维丝作为特定机械刺激检测小鼠的抬腿频率变化来反映其机械痛阈的变化情况,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的机械痛阈行为学变化情况;(4)用2.5 s辐射热刺激作为特定刺激时长(调节辐射热基础强度,使野生型对照组小鼠的后肢抬腿潜伏期为10-12s)观测小鼠的热痛阈变化情况,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的热痛阈行为学变化情况;(5)使用全细胞膜片钳技术,记录脊髓Ⅱ层胶质区神经元的微小兴奋性突触后电流(m EPSC)情况,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组之间m EPSC的频率和幅度差异;(6)使用全细胞膜片钳技术,记录脊髓Ⅱ层胶质区神经元的静息膜电位,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的之间静息膜电位的去极化程度差异;(7)使用全细胞膜片钳技术,记录脊髓Ⅱ层胶质区神经元的注入电流诱发单个动作电位的幅值,比较野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组的之间动作电位幅值的差异。结果(1)通过结扎部分坐骨神经建立稳定的PSNL神经病理性疼痛小鼠模型,野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠均出现舔足频率增加,脚掌不敢长时间落地等痛觉过敏现象;(2)与野生型假手术组相比,野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定机械刺激痛反应频率都有显著提高,与野生型PSNL手术组相比,P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定机械刺激痛反应频率较低;(3)与野生型假手术组相比,野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定热刺激痛反应频率都有显著提高,与野生型PSNL手术组相比,P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的特定热刺激痛反应频率较低;(4)野生型PSNL手术组脊髓背角Ⅱ层胶质区神经元的微小兴奋性突触后电流(m EPSC)的频率和幅度比野生型假手术组小鼠显著增加;P2Y12基因敲除PSNL手术组m EPSC的频率和幅度比P2Y12基因敲除假手术组小鼠的显著增加;但P2Y12基因敲除PSNL手术组m EPSC的上升频率和幅度比野生型PSNL手术组小,有显著统计学差异;(5)野生型PSNL手术组小鼠脊髓背角Ⅱ层胶质区神经元的静息膜电位数值比野生型假手术组显著增加,说明神经元因为手术而有去极化改变;P2Y12基因敲除PSNL手术组小鼠的静息膜电位也出现了去极化改变;但P2Y12基因敲除PSNL手术组和野生型PSNL手术组间的静息膜电位数值无统计学差异,说明无显著去极化程度差异;(6)野生型假手术组、野生型PSNL手术组和P2Y12基因敲除假手术组、P2Y12基因敲除PSNL手术组之间的注入电流(2 ms、1000 p A)诱发的单个动作电位幅值无统计学差异,说明钠钾离子通道的开放程度近似,即手术后7天和P2Y12基因敲除对钠钾离子通道的开放程度未造成显著性改变。结论与野生型PSNL手术小鼠相比,P2Y12基因敲除小鼠神经结扎导致的疼痛行为学表现减弱;脊髓背角Ⅱ层神经元的m EPSC的频率和幅度增加程度减弱,说明虽然P2Y12基因敲除小鼠的术后兴奋性突触传递增强,但野生型小鼠的增加程度更显著;术后,野生型和P2Y12基因敲除小鼠的静息膜电位都发生了去极化表现,说明神经元兴奋性增加了,但是两组间无统计学差异,说明术后P2Y12基因敲除小鼠的兴奋性突触传递强度虽然不如野生型,但是,两组的脊髓背角Ⅱ层神经元都有兴奋性增加现象,但本部分实验结果表明P2Y12基因敲除对其影响不显著,可能是因为本身差异不大所以需要增加样本量才能说明问题;注入电流诱发的单个动作电位无差异则说明术后7d和P2Y12基因敲除还不能对检测神经元整体的钠钾离子通道产生显著性影响。