鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是从身体健康的人体肠道中分离出来的,是国家所认可的第三代益生菌中的一种,也是全球最受关注的一种乳酸菌。由于鼠李糖乳杆菌可在肠道中定植,且能够耐受人体和动物消化道的酸碱环境,具有调和肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除体内毒素、预防龋齿以及提高机体免疫力等功能特性,所以近些年来鼠李糖乳杆菌成为各科研人员所钟爱的菌种。目前市场上的以乳酸菌为发酵剂的产品多为保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌,而以鼠李糖乳杆菌为发酵剂的产品鲜少,究其原因主要是由于鼠李糖乳杆菌的活菌数不够高所导致的。所以本研究通过对由本实验室保藏的一株鼠李糖乳杆菌YYJP-2的高密度发酵进行初步探索,力求促进鼠李糖乳杆菌YYJP-2的生长繁殖,最终达到高密度发酵。本实验的主要研究内容如下:(1)通过对鼠李糖乳杆菌YYJP-2生长繁殖状况的连续追踪收集数据,掌握该菌的生长繁殖情况及规律,绘制准确的生长曲线,并有生长曲线图确定了生长发酵了14-16h的鼠李糖乳杆菌YYJP-2为最好的发酵种子,18h时鼠李糖乳杆菌YYJP-2活菌数最高。(2)通过单因素实验,最终确定最佳发酵外部条件。所优化的外部条件主要有培养温度、接种量以及培养基的起始p H。这些外部条件的最终优化结果为:培养温度35℃,接种量3%,起始pH6.5。(3)以MRS培养基为基础,通过单因素实验确定碳源的种类及最佳添加量;实验室所用的蛋白胨种类较多,所以通过单因素实验确定蛋白胨种类,之后确定蛋白胨、牛肉膏、酵母粉的最佳添加量,通过正交试验的到混合氮源的最优配比。优化培养基中的碳源、氮源的种类和添加量分别为:葡萄糖20g/L;多价蛋白胨15 g/L,牛肉膏20 g/L,酵母粉15 g/L。(4)通过添加缓冲盐体系来解除或降低乳酸对该菌生长繁殖的抑制作用。通过磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、磷酸二氢钾/氢氧化钠、磷酸氢二钠/柠檬酸、磷酸氢二钠/磷酸二氢钾四种缓冲盐的单因素实验,确定最有利于菌体生长繁殖的缓冲盐体系及最佳添加量。最终确定优化培养基中所添加的缓冲盐体系为:磷酸二氢钾/氢氧化钠0.10mol/L。(5)在以上结果的基础上,以碳源、氮源、缓冲盐为影响因素,以活菌数为响应值,通过Box-Benhnken design(响应面分析)试验设计,根据得出的实验结果建立二次响应面回归模型,以寻求碳源、氮源、缓冲盐的最优实验配比,达到优化鼠李糖乳杆菌培养基的目的。最终结果为:葡萄糖40 g/L,氮源为的混合氮源(多价蛋白胨:牛肉膏:酵母粉=15:20:15)的1.39倍,缓冲盐磷酸二氢钾/氢氧化钠0.05 mol/L。考虑到操作的可行性,设定葡萄糖40 g/L,氮源为混合氮源(多价蛋白胨:牛肉膏:酵母粉=15:20:15)的1.4倍、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲盐0.05 mol/L。在此条件下发酵,所得活菌数为9.2×10~9 CFU/mL。(6)在优化培养基的基础上添加50mL的富氢水,发现富氢水严重影响了鼠李糖乳杆菌YYJP-2的生长,活菌数降低51.9%。具体原因尚未清楚,有待后续实验研究。(7)通过对发酵液中还原糖、乳酸含量的测定,确定磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲盐体系使培养基中的乳酸含量降低了13.3%;通过原子吸收光谱测定发酵液中的钾、钠、镁、等化学元素,发现部分镁被菌体利用,而钾、钠、磷含量比发酵前的高,具体原因尚未清楚,有待后续实验研究。