肿瘤细胞代谢异常是新近发现的肿瘤组织有别于正常组织的十大特征之一。其中，肿瘤细胞的糖代谢异常尤为突出，主要表现为有氧糖酵解通路增强和氧化磷酸化途径减弱，即肿瘤细胞即使在有氧条件下，也主要通过糖酵解方式分解葡萄糖获能，而非通过三羧酸循环的氧化磷酸化途径生产ATP。肿瘤细胞这种有氧糖酵解为主的代谢方式被称之为“Warburg”效应，这种独特的代谢方式带来了三大优势:①为肿瘤细胞增殖提供了必需的能量ATP;②提供了充足的中间产物、用于核酸、脂质和蛋白质等生物大分子的合成原料物质，是肿瘤细胞快速增殖的物质基础;③不断生成参与氧化还原反应的辅因子（NADPH及NADH），避免快速增殖导致的氧化损伤。此外，肿瘤细胞这一特殊的糖代谢特征还贡献于肿瘤凋亡抵抗，恶性微环境的维持，转移与耐药等方面，是肿瘤细胞存活与增殖的坚强后盾。当前，肿瘤细胞的代谢异常成为肿瘤研究领域的前沿热点，靶向肿瘤有氧糖酵解被认为是极富潜质的抗肿瘤新策略。　　靶向有氧糖酵解代谢通路的核心是调控各步化学反应的代谢酶，特别是调控关键步骤的限速酶，是有效干预有氧糖酵解的关键所在。丙酮酸脱氢酶激酶(PDHK)是肿瘤糖代谢的调节网络的关键节点分子，处于有氧糖酵解和氧化磷酸化两大通路的分支节点，调控最重要的代谢中间产物——丙酮酸的去向，是糖代谢通路起关键枢纽作用的限速酶。PDHK通过磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)，抑制PDH复合物(PDC)的活性，抑制丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)，从而切断丙酮酸进入三羧酸循环(TCA cycle)的唯一途径，进而减慢线粒体内氧化磷酸化进程，促进丙酮酸通过有氧糖酵解途径转化生成乳酸。目前已报道PDHK有四种亚型(PDHK1-4)，它们具有特异性的组织分布，且对底物PDH最主要的活性调节位点-丝氨酸293位点(S293)的均有调控作用。近年来，越来越多的研究表明，PDHK尤其是PDHK1在多种肿瘤组织中都存在异常高表达，并且与肿瘤患者的预后和生存、放/化疗响应、耐药的产生等都密切相关。特别值得关注的是，PDHK1还直接承接上游癌基因信号，实现癌基因对肿瘤细胞代谢的调控。例如，转录因子c-Myc、酪氨酸激酶FGFR、BCR-ABL，JAK2以及MicroRNA-Let7等都可在不同层面调控PDHK1，进而调控肿瘤糖代谢。因此，PDHK1已成为靶向肿瘤糖代谢的抗肿瘤策略中极具潜质的靶点。　　目前，肿瘤代谢抑制剂研究才刚刚起步，仅有4个PDHK抑制剂被报道，按照作用机制可以分为三类:ATP竞争型抑制剂根赤壳菌素(Radicicol);阻碍PDHK与PDC结合的抑制剂AZD7545和Nov3r;构像调节剂二氯乙酸(DCA)。值得关注的是，除DCA外，目前已有的PDHK抑制剂都处于研究早期，且上述三类PDHK抑制剂均存在明显的不足:Radicicol靶向选择性差;AZD7545的体内抗肿瘤活性不明显;DCA尽管在仅有5人参与的小样本神经胶质瘤患者临床实验中显示出一定的治疗效果，但其对PDHK的活性弱，IC50为毫摩尔水平，且选择性差，体内活性可能与其它靶点作用有关。可见，靶向PDHK抗肿瘤药物研究具有极大的探索空间，特别是寻求全新作用机制的PDHK抑制剂，极有可能带来突破性进展。另外，当前PDHK抑制剂的敏感人群未知，这也为PDHK抑制剂抗肿瘤活性的评价带来了挑战。探究其敏感群体和相关生物标志物，将为PDHK抑制剂抗肿瘤活性的评价指明方向，大大提高PDHK抑制剂的研发成功率。　　为了寻求PDHK抑制剂抗肿瘤研究的突破，本研究广泛筛选化合物，旨在发现靶向性和抑制活性更好，具有新结构和新机制的PDHK抑制剂;在评价化合物逆转肿瘤细胞代谢异常和抗肿瘤活性的基础上，本研究将着力阐明化合物作用模式及调控PDHK酶活的分子机制，旨在为PDHK抑制剂的研究提供新的思路和候选化合物。与此同时，本研究将开展PDHK抑制剂敏感群体研究，希望为PDHK抑制剂未来研究的临床应用提供重要的信息。　　本研究首先利用所在课题组前期已建立的基于酶联免疫吸附实验(ELISA)的PDHK抑制剂分子水平筛选体系和基于高内涵的细胞水平评价模型，对3590个化合物进行PDHK1抑制剂的筛选，得到活性化合物JX01。进一步，通过对JX01进行系列的化学改造和构效关系研究，得到分子和细胞水平活性均有显著提高的化合物JX06，论文工作围绕JX06展开。　　第一章:PDHK抑制剂JX06抗肿瘤作用及敏感群体研究　　基于ELISA的酶活实验表明，JX06在分子水平对PDHK1-3均有很强的抑制作用，对PDHK1的IC50为49 nM，低于已报道化合物，而对PDHK4无显著抑制活性。同时，JX06对涵盖丝氨酸激酶家族的319种在肿瘤发生发展中具有重要作用的激酶无明显抑制活性，体现出其对PDHK很强的选择性。JX06能显著抑制肿瘤细胞PDHK下游通路，剂量依赖地抑制PDH S232和S293的磷酸化，并激活PDC活性。JX06对PDHK活性的抑制伴随着其对肿瘤细胞代谢特性的逆转，研究发现JX06能够增加肿瘤细胞对葡萄糖的摄取和胞内ATP生成，同时降低细胞乳酸分泌，提示JX06能够激活氧化磷酸化通路，抑制有氧糖酵解途径，调控细胞糖代谢重新编排。同时，JX06能显著抑制肿瘤细胞增殖，且过表达和干扰PDHK1均能逆转JX06的抗肿瘤作用，提示其抗肿瘤作用主要通过靶向PDHK1实现。进一步研究发现，JX06对肿瘤细胞代谢通路的影响，可通过异常激活敏感群体的线粒体呼吸，增加线粒体内活性氧含量(ROS)，进而降低线粒体膜电位(MMP)，最终导致细胞凋亡的发生，实现其抗肿瘤作用。而JX06对不同肿瘤细胞ROS诱导能力的差异，提示其敏感群体的存在。　　为此，我们从肿瘤细胞的糖代谢基础状态入手，找寻可指征JX06作用的标志物。通过对20株细胞（包括17株肿瘤细胞和3株正常细胞）基础糖代谢指标（包括氢离子生成速率（ECAR，指征有氧糖酵解激活程度）和氧气消耗速率（OCR，指征氧化磷酸化激活程度））以及JX06对这二十株肿瘤细胞增殖敏感性的测定，我们发现ECAR/OCR值与JX06增殖抑制的IC50值之间存在显著相关性，即EACR/OCR越高，对有氧糖酵解越依赖的肿瘤细胞，对JX06越敏感。该相关性提示ECAR/OCR可能做为指征PDHK1敏感群体的标志物。进一步，我们在裸小鼠皮下移植瘤模型上验证了JX06对敏感和不敏感细胞的体内抗肿瘤活性。在敏感细胞A549裸小鼠移植瘤模型中，每天腹腔注射给药80 mg/kg和40 mg/kg，化合物JX06可显著抑制PDHK下游信号通路，有显著的体内抗肿瘤效果，相对肿瘤增殖率(T/C)值分别为47.35％和61.06％(P＜0.01)，并伴随着血清中的乳酸水平的显著降低。而在不敏感细胞HT-29裸小鼠移植瘤模型中，JX06虽可显著抑制PDHK信号通路，但却无抑制肿瘤生长效果。　　第二章:JX06抑制PDHK作用机制研究　　为了阐明JX06抑制PDHK的分子机制，我们从分析JX06的活性中心入手，通过化学结构改造和生物学同步评价，我们发现JX06分子中的二硫键和硫代酰胺为JX06发挥PDHK抑制作用的关键基团。该结果提示，JX06可能是通过与PDHK半胱氨酸发生共价反应来发挥抑制作用的。接下来，我们设计系类实验证实了该假说:谷胱甘肽可逆转JX06对PDHK抑制作用;生物素偶联的JX06(Biotin-JX06)垂钓实验表明JX06能与PDHK1发生共价反应。进一步，通过点突变实验证实JX06通过对PDHK1的240位半胱氨酸(C240)的共价修饰抑制PDHK1的酶活，质谱检测提供直接证据表明JX06 C240对有共价修饰作用。上述实验结果共同证实JX06是PDHK1的共价抑制剂，通过对PDHK1 C240位的修饰抑制其酶活功能。　　高选择性的共价抑制剂作用的发挥依赖于对特异性作为位点附近结合口袋的识别和结合。计算模拟对接提示PDHK1 C240周围存在JX06结合口袋，采用氨基酸突变改变该口袋的大小或电性，干预PDHK1的结合可显著减弱JX06对PDHK1的抑制活性。更进一步，结合计算机模拟、氨基酸突变和激酶活性测试，我们发现JX06可能通过与C240的结合，引起R286侧链的扭转，进而影响ATP结合口袋构象，导致PDHK1催化活性降低。增加ATP浓度能够逆转R286突变体的活性。上述结果JX06对C240位点的共价修饰如何影响PDHK1的酶活提供了机制解释。　　综上，本研究发现了首个肿瘤代谢关键激酶PDHK1的共价抑制剂，证明了其抗肿瘤作用，为靶向PDHK抗肿瘤药物研究提供了重要的先导化合物;以JX06为探针，阐明了C240位点共价修饰的酶活调控机制，并发现了结合口袋，使得靶向PDHK1 C240位点的共价抑制成为可能，提出了新的PDHK靶向策略;本研究还发现PDHK1抑制剂的敏感群体和相关的标志物，对准确评价肿瘤代谢抑制剂的抗肿瘤活性、提高PDHK抑制剂的临床响应率具有重要意义。