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细胞过继免疫治疗（Adoptive cell immunotherapy,ACT）作为肿瘤免疫治疗中最有前景的疗法之一,其效果主要取决于两点:一是回输进体内的细胞能否具有较强的肿瘤抑制与杀伤能力;二是能否具有在体内长期存活及增殖的能力。CD4+T细胞在不同的极化条件下能分化为不同的细胞亚群,其功能与生物学特性各不相同,应用到过继治疗中的效果也不相同。Th1细胞效应性较强但持久性不够,而Th17细胞持久性较好但效应功能又有所欠缺。新近发现,在TGF-β联合IL-4条件下分化形成的Th9细胞兼具较好的效应功能和持久性,在小鼠黑色素瘤过继治疗模型中显示出优于Th1细胞和Th17细胞的治疗效果。本研究旨在阐述IL-36γ对Th9细胞分化的促进作用,探讨IL-36γ促进分化的Th9细胞的生物学特性及其肿瘤过继免疫治疗作用的效应与机制。第一部分IL-36γ促进Th9细胞分化及其效应特性的研究[目的]研究IL-36γ对Th9细胞分化的促进作用,并分析IL-36γ促进分化的Th9细胞的效应特性。[方法]磁珠分选C57BL/6j或OT-Ⅱ小鼠的CD4+T细胞,用anti-CD3/anti-CD28包板或负载OVA323-339抗原肽的抗原提呈细胞刺激其活化,分别在 TGF-β+IL-4、TGF-β+IL-36γ和TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞因子条件下,分化为相应的Th9TGF-β+IL-4、Th9TGF-β+IL-36γ、Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞。采用转录组测序以及实时荧光定量PCR检测,分析这3种细胞相关转录因子、细胞因子、效应分子及免疫卡控点分子的表达;利用流式细胞术检测IL-9、免疫卡控点分子PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT的表达;通过加入不同浓度的STAT6、STAT5、NF-κB信号通路抑制剂,采用流式细胞术和ELISA检测IL-9的表达,分析IL-36γ促进Th9细胞分化所依赖的信号途径。[结果]与经典条件分化的Th9TGF-β+IL-4细胞相比,Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞相关转录因子PU.1、Hif1α、IRF1、BATF3在mRNA水平的表达增加,相关细胞因子IL-9、IL-21以及效应分子IFN-γ、GzmA在mRNA水平呈上调表达,免疫卡控点分子PD-1、TIM-3的mRNA及蛋白水平呈下调表达。IL-36γ能显著促进Th9细胞的分化,增强特征性细胞因子IL-9蛋白水平的表达,且呈剂量依赖性;在加入STAT6、STAT5、NF-κB信号通路抑制剂后,IL-36γ对Th9细胞分化的促进作用被明显抑制。此外,Th9TGF-β+IL-36γ细胞能表达与Th9TGF-β+IL-4细胞相似水平的IL-9,上调转录因子PU.1、Hif1α以及效应分子IFN-γ的mRNA的表达,同时下调部分免疫卡控点分子PD-1、TIM-3的mRNA及蛋白水平的表达。[结论]IL-36γ能够在经典诱导条件的基础上显著促进Th9细胞的分化,且依赖于STAT6、STAT5、NF-κB信号的调控,Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞表现出更强的效应功能,并且低表达免疫卡控点分子。此外,使用IL-36γ替换IL-4也能有效诱导Th9细胞的分化。第二部分IL-36γ促进分化的Th9细胞在肿瘤过继免疫治疗中的作用及其机理的研究[目的]研究IL-36γ促进分化的Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞在黑色素瘤小鼠过继转移治疗模型中的作用及机制。[方法]在CD45.2表型的C57BL/6j小鼠腹部接种B16-OVA细胞,构建荷瘤小鼠模型;在接种肿瘤细胞后第6天,给小鼠注射体外诱导活化的骨髓来源的树突状细胞（BMDC）以及不同分化条件下诱导的具有OVA抗原特异性的CD4+T 细胞（Th1、Th9TGF-β+IL-4、Th9TGF-β+IL-36γ、Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ）;记录肿瘤生长情况并观察荷瘤小鼠生存期。在过继治疗后第10和第20天,通过流式细胞术分析肿瘤引流淋巴结、脾脏、肿瘤组织中外源性CD4+T细胞、内源性CD4+T细胞以及CD8+T细胞在体内的存活情况及增殖能力,并分析其效应分子以及免疫卡控点分子的表达情况。[结果]IL-36γ促进分化的Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞与经典的Th9TGF-β+IL-4细胞相比,在肿瘤过继免疫治疗中能显著抑制肿瘤生长,并延长荷瘤小鼠的生存期。在过继治疗后的第10天,与Th9TGF-β+IL-4细胞治疗组相比,Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞治疗组荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结、脾脏、肿瘤组织中外源性CD4+T细胞比例明显增加,表达较高的核抗原Ki67;脾脏内外源性CD4+T细胞中免疫卡控点分子PD-1、KLRG1、TIGIT、TIM-3、BTLA呈相对较低水平表达;肿瘤组织内外源性CD4+T细胞表达与经典Th9TGF-β+IL-4细胞相似水平的效应分子,其内源性CD4+T细胞、CD8+T细胞的IFN-γ、GzmB、TNF-α表达均上调。在过继治疗20天后,Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞治疗组荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结、脾脏、肿瘤组织中外源性CD4+T细胞比例仍然显著高于经典Th9TGF-β+IL-4细胞治疗组,且表达较高水平的IL-7Rα。Th9TGF-β+IL-36γ细胞与Th9TGF-β+IL-4细胞相比,明显延长了荷瘤小鼠的生存期,其部分免疫卡控点分子表达下降,部分效应分子表达增加,在肿瘤进展早期具备更强的存活与增殖能力。[结论]与经典Th9TGF-β+IL-4细胞相比,Th9TGF-β+IL-4+IL-36γ细胞在小鼠黑色素瘤过继治疗模型中显示出了显著的抑制肿瘤生长的能力,在体内具有更强的存活、增殖能力;其低表达免疫卡控点分子,表现出不易耗竭的特征;能够促进小鼠肿瘤内自身来源的淋巴细胞高表达效应分子。此外,Th9TGF-β+IL-36γ细胞与Th9TGF-β+IL-4细胞相比,在肿瘤过继免疫治疗中也具有优良的特性,可延长荷瘤小鼠的生存期。