【摘 要】
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目的:α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR）是由Chrna7基因编码的蛋白,本实验通过生物信息学软件预测可能与Chrna7基因启动子区存在结合位点的转录因子,对筛选出的转录因子Sp1与α7 nAChR在偏头痛大鼠下丘脑弓状核（hypothalamic arcuate nucleus,ARC）内的表达及两者的靶向关系进行研
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目的:α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7 nAChR）是由Chrna7基因编码的蛋白,本实验通过生物信息学软件预测可能与Chrna7基因启动子区存在结合位点的转录因子,对筛选出的转录因子Sp1与α7 nAChR在偏头痛大鼠下丘脑弓状核（hypothalamic arcuate nucleus,ARC）内的表达及两者的靶向关系进行研究,探讨Sp1是否通过调控α7 nAChR参与偏头痛,为寻找偏头痛治疗的新靶点提供实验依据。方法:（1）以成年雄性大鼠为实验对象,进行连续7天的电刺激（electrical stimulation,ES）建立大鼠偏头痛模型,采用von-Frey方法检测大鼠眶周皮肤机械痛阈值变化。（2）酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测 ES大鼠血浆内降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）含量变化。（3）双荧光素酶报告基因（dual-luciferase reporter assay）筛选Chrna7基因启动子核心区域,生物信息学软件预测转录因子Sp1与Chrna7启动子区靶向结合位点。（4）染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）检测 Sp1 与Chrna7启动子区的结合情况。（5）实时荧光定量 PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）检测ES大鼠ARC内α7 nAChR和Sp1 mRNA表达变化。（6）蛋白质免疫印迹（western blot）检测ES大鼠ARC内α7 nAChR和Spl蛋白表达变化。（7）免疫荧光（immunofluorescence）检测神经元激活标志c-Fos的表达情况及α7 nAChR、Sp1在ARC神经细胞内的定位。（8）ARC内微量注射α7 nAChR激动剂PNU282987或过表达α7 nAChR、注射Sp1 siRNA后,检测ES大鼠痛行为变化及相应的α7 nAChR和Sp1 mRNA与蛋白表达变化。结果:（1）电刺激2天后,ES组大鼠眶周皮肤机械痛阈值与sham组相比出现显著降低,第7天达到最低值,在电刺激停止后逐渐恢复。（2）ES大鼠血浆内CGRP含量相比sham组显著升高。（3）ES组大鼠ARC内c-Fos表达明显增加,且大多数c-Fos与α7 nAChR存在共标,提示ES大鼠ARC内α7 nAChR阳性神经元被激活。（4）ES大鼠ARC内α7 nAChR的mRNA和蛋白表达水平显著降低,与sham组相比具有显著差异。ARC内微量注射α7 nAChR选择性激动剂PNU282987后2和4h,ES大鼠机械痛阈值显著升高。ARC内过表达α7 nAChR后,ES大鼠机械痛阈值在电刺激第4天与NC组出现显著差异,降低幅度减小,降低时间点推迟,产生镇痛作用。（5）构建Chrna7基因启动子区荧光素酶截短体,双荧光素酶报告基因检测在-1567～-1169 bp序列中存在转录因子能够负向调控α7 nAChR表达。（6）生物信息学软件预测Sp1与Chrna7基因启动子区存在结合位点,双荧光素酶报告基因证明了 Sp1靶向结合Chrna7启动子区并且负向调控α7 nAChR表达,同时ChIP-PCR结果显示ES大鼠Sp1与Chrna7启动子区结合度明显高于sham 组。（7）ES大鼠ARC内Sp1的mRNA和蛋白表达水平显著升高,与sham组具有显著差异,同时Sp1与α7 nAChR存在共表达。（8）ARC内注射Sp1 siRNA后,Sp1的mRNA和蛋白表达水平与NC组相比显著下降,α7 nAChR的mRNA和蛋白表达水平与NC组相比则显著增加,大鼠机械痛阈值显著升高,证明Sp1能负向调控α7 nAChR的表达。结论:电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜可诱导偏头痛并激活下丘脑弓状核神经元;下丘脑弓状核内转录因子Sp1通过与Chrna7启动子区靶向结合,负向调控α7 nAChR表达参与电刺激诱导的偏头痛。
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