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目的:通过毕赤酵母真核表达系统表达分泌型磷脂酶A2（secreted phospholipase A2,sPLA2）GⅡE。比较BSM培养基与YPD培养基对sPLA2 GⅡE的表达水平,优化提升sPLA2 GⅡE表达效果。通过sPLA2 GⅡE的定点突变、酶活性测定、钙亲和力实验以及结构模拟实验,阐明其钙结合机制。方法:本研究采用大肠杆菌原核表达系统重组表达sPLA2 GⅡE蛋白,采用毕赤酵母真核表达系统对sPLA2 h GⅡE进行蛋白表达。利用BSM培养基和YPD培养基对目的蛋白进行表达,优化提升sPLA2 GⅡE的表达水平。设计并表达sPLA2 GⅡE突变体。利用sPLA2酶活性检测试剂盒,测定不同类型sPLA2蛋白的酶活性,计算酶活百分比。利用Biacore T200系统测定钙结合解离,计算平衡常数（Kd）。利用分子模拟技术,构建sPLA2 GⅡE突变体模型,分析sPLA2 GⅡE的钙结合机制。本研究分为蛋白表达优化、纯化、酶学实验、钙结合测定和分子模拟四部分。1.表达优化、纯化:根据sPLA2 GⅡE蛋白核酸序列设计引物,经PCR反应扩增目的基因;构建入酵母细胞表达载体p GAPZαA;转化大肠杆菌top10感受态细胞;提取重组质粒,使用Bln I限制性内切酶线性化后电转转入酵母细胞。挑取阳性克隆单菌经过YPD液体培养基（含100μg/m L Zeocin）逐级培养扩增至三级种,将三级种子液分为两个对照组,分别接入YPD培养基和BSM培养基中200 rpm,28℃培养55～60 h。在培养过程中每6 h采样一次,测定其OD值和酶活。将获得的培养液在4℃下10000r离心5 min,弃去沉淀,得到上清;用0.45μm的滤膜对上清液进行过滤除菌;用Vivaflow 200系统浓缩;用缓冲液（10 m M MES p H 6.0）稀释4倍。采用阳离子柱对样品进行初步纯化;采用浓缩管对收集到的样品进行浓缩;采用Superdex200对样品进行精细纯化。在纯化过程中,每一步都收集样品,通过进行SDSPAGE跑胶验证和sPLA2酶活测定试剂盒检测蛋白的表达情况;评估蛋白纯化得率。2.酶学实验:构建sPLA2 GⅡE突变体,通过酶活测定实验和钙结合解离常数测定,观察不同突变类型蛋白酶活的变化。采用sPLA2酶活测定试剂盒（Cayman,Ann Arbor,USA）对sPLA2 GⅡE野生型和突变体进行测定。该试剂盒的底物为1,2-二硫代二庚酰卵磷脂类似物（DTPC）。当sPLA2与底物发生反应后,sn-2位的硫酯键发生水解,产生的带负电的硫原子会与DTNB发生反应,显色,在414nm波长处可以检测到吸收光。3.钙结合测定:将4000-5000个反应单位（RU）纯化的WT GⅡE和3个突变蛋白分别固定在CM5传感器芯片上。在无钙离子缓冲液环境下,以10μL/min的流速测定,温度25℃。用运行缓冲液稀释1 M Ca Cl2,使其最终浓度分别为3.125μM,12.5μM,50μM,200μM,800μM和3200μM。以没有固定化蛋白的参比细胞作为非特异性结合对照。收集数据,用Biacore T200软件3.1版中的“亲和力”模型计算平衡常数（Kd）。4.分子模拟:用Web Swiss-Model构建了sPLA2 GⅡE突变体模型。使用Discovery Studio软件包3.5版本,构建的模型在显式溶剂中进行了求解。进一步的能量最小化是为了消除任何残留的几何约束,使用最陡下降算法。最大步数设置为1000,最终均方根梯度小于0.1 kcal/（mol x（?））。在模拟前后没有发现模型有显著差异。选择合理的模型进行分析。结果:1.通过酵母真核表达系统成功表达sPLA2 GⅡE;通过培养基优化,利用BSM培养基表达蛋白,经过离子交换、分子层析获得纯度较高的蛋白,且获得的sPLA2GⅡE有较好的酶活性。2.sPLA2 GⅡE的突变体成功构建,且突变体的酶活较野生型sPLA2 GⅡE有不同程度的酶活下降。其中,16E、N21G-D22F和16E-N21G-D22F相对野生型sPLA2GⅡE分别下降到了59.1%、10.62%和9.13%。3.WT GⅡE显示出钙结合能力,Kd为0.50 mmol/L,3个突变体16E钙亲和力降低至2.76倍,N21G-D22F和16E-N21G-D22F分别降低到10.12倍和5.44倍。4.与WT GⅡE相比,GⅡE突变体16E Ca2结合位点没有明显变化。与GⅡE中Ca2可以稳定的假设相反,突变体N21G-D22F和突变体16E-N21G-D22F的模型中不存在Ca2,没有Ca2结合。结论:Ca2对分泌型磷脂酶A2 GⅡE的酶活机制起到重要作用。在反应过程中,Ca2作为Ca1的后援间接参与了催化作用。