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脂肪酶是最早被人类发现、研究和利用的酶类之一,现已在食品,医药,能源等行业中广泛应用。其中,利用其位置专一性生产高附加值结构脂以及其介导的化学酶法生产环氧和内酯型化合物更是极具经济效应和前景的两个应用方向。但是,在相关领域的生产实践中,现有脂肪酶的催化性能还无法满足绿色制造的全部需求,而酶的改造常常使用结果无法预知的定向进化来完成。因此,为了避免冗长而随机的筛选过程,需要解析相应的分子机制来指导脂肪酶的改造。而且在后基因组时代,分子机制的解析也能提高具有特定属性的新酶的挖掘效率。本论文以来源于Streptomyces sp.strain W007和Penicillium camembertii的脂肪酶（简称为MAS1和PCL脂肪酶）为研究对象,综合运用生物计算、分子生物学及生化表征技术来探究脂肪酶位置选择性的分子机制和H2O2驱使脂肪酶失活的机制并提出和验证了位置选择性改造和H2O2耐受性提升策略。同时,也为酶的机制研究和改造提供了新的思路。具体研究内容和结果如下:一、MAS1脂肪酶无位置选择性的分子机制及其位置选择性改造策略（1）决定MAS1脂肪酶位置选择性的结构基础:结构比对发现MAS1脂肪酶的催化口袋可分为三个子区域（Pocket A,B和C）,分别用于结合甘油三酯（TAG）的三条链。通过同源模拟和手动分子对接获得了三辛酸甘油酯（TC8）分别以sn-1,sn-2和sn-3位反应模式与MAS1脂肪酶结合的构象。比较这三种底物结合构象发现,当TC8以sn-2位反应模式与酶结合时,底物的甘油骨架被紧紧包裹而几乎失去构象调整的空间;而其以sn-1和sn-3位反应模式与酶结合时甘油骨架所受约束较少,因此可以较自由地调整底物的构象。当将口袋底部的H108突变成色氨酸来增加位阻时,MAS1脂肪酶因为无法再接纳sn-2位的结合构象而失去了对TAG的sn-2位反应活性。但是,因为突变可能没有影响到TC8以sn-1或sn-3位反应模式与酶结合,所以突变体H108W成了sn-1,3位专一性脂肪酶。而且MD模拟和催化残基S109和H232的突变实验揭示了MAS1脂肪酶的口袋中还存在一个由H108,G37和N45（均位于Pocket B）组成的结合位点用以结合TC8的sn-2位反应构象中不参与反应的sn-1位极性基团。这个位点的存在可以提高MAS1脂肪酶中以sn-2位反应模式结合的甘油三酯底物的稳定性,这也是MAS1脂肪酶具有sn-2位活性并表现为无位置选择性的一个重要原因。因此,重塑该位点可能能实现MAS1脂肪酶位置选择性的改造。（2）MAS1脂肪酶位置选择性改造策略:生化表征实验发现,在G40,N45,H108和T237位点（均位于Pocket B）设计的突变体的位置选择性指数（PSI）遍布-30到100（涵盖了无位置选择性,弱sn-1,3和强sn-1,3位选择性三个层次）,这表明MAS1脂肪酶的位置选择性可以通过突变进行调控。从突变体MD模拟的结构中我们总结出了调节MAS1脂肪酶位置选择性的规律。增加Pocket B中残基与以sn-2位反应模式进入口袋的TAG极性部分（即甘油骨架）的静电相互作用、避免不参与反应羰基的结合位点附近存在带负电基团的残基、提高Pocket B的构象稳定性可提高其sn-2位偏好;而除去破坏上述的条件外,在Pocket B中引入大侧链残基来封闭以sn-2位反应模式进入口袋的TAG的通道或者堵住其甘油骨架羰基的结合位点就可以减弱其对于sn-2位的偏好,甚至使其转变成sn-1,3位专一性脂肪酶。二、H2O2引起PCL脂肪酶失活的机制及提升其H2O2耐受性的改造策略（1）H2O2驱使PCL脂肪酶钝化的机制:QM/MM MD模拟揭示了底物H2O2分子的构象通过与PCL脂肪酶中Y21、H144和H259三个残基形成氢键而被稳定。CMD模拟的结果显示,PCL脂肪酶极性口袋能同时容纳2-4个H2O2分子且只有1个H2O2能与酶稳定结合。通过SMD模拟我们知道了出现这种现象是因为H2O2进入PCL脂肪酶的H2O2结合位点是一个低能垒的放热过程,换而言之,H2O2更倾向于待在其口袋中。QM/MM MD模拟结合突变实验证明氧化敏感残基Y21和H144的化学性质改变后PCL脂肪酶的活力将严重受损。因此极有可能是口袋中未被结合的“游离”H2O2分子攻击了这两个残基才导致酶的快速失活。（2）提升脂肪酶H2O2耐受性的改造策略:为提高PCL脂肪酶的H2O2耐受性,我们提出了在酶口袋上方引入极性氨基酸的方法,通过让它们与H2O2形成氢键来增加其进入催化口袋的能垒。CMD模拟的结果显示突变体Y84R、F256Y、I260E和I260R都能有效减少口袋中H2O2分子的数量,其中以Y84R和I260R效果最佳。实验证明突变体F256Y,I260E,Y84R和I260R在1 M H2O2条件下孵育的半衰期分别较野生型提升了1.41,3.66,4.17和4.40倍,实验结果与理论预测一致。SMD模拟的结果显示突变体Y84R和I260R中引入的精氨酸确实通过与H2O2的氢键作用提高了其进入口袋的能垒,但没有改变H2O2倾向于待在PCL脂肪酶极性口袋的特征。QM/MM MD模拟显示突变体I260R未改变PCL脂肪酶催化过水解过程的反应自由能特征,但Y84R提高了该反应中决速步的能垒。因此I260R与野生型的催化效率接近,但Y84R则有所下降。而这与生化实验的结果也一致。最后,在两个同源脂肪酶上也对该策略进行了验证,并获得了类似的正向结果,这表明该策略可在其他与H2O2相关的酶上推广。