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第一部分 血小板CEACAM5对急性冠脉综合征诊断价值的研究[目 的]急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome,ACS）是冠脉完全或不完全性闭塞导致心肌急性缺血而引发的一系列临床综合征,可导致心源性休克、心脏猝死等严重不良心血管事件,快速且准确诊断ACS有助于有效临床决策和及时血运重建,可有效提高患者生存率。然而,心肌肌钙蛋白（Cardiac troponin,cTn）在心肌损伤最初几小时内缺乏敏感性,且无法识别心肌损伤的具体机制。因此,寻求敏感性更高、特异性更强的新型生物标志物对ACS的诊断至关重要。本研究旨在探索癌胚抗原相关粘附分子5（Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules 5,CEACAM5）在正常健康人血小板上的表达情况及其在ACS诊断中的价值,以及其对血小板聚集、释放、粘附等功能的影响。[方 法]分别采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot,WB）以及双色流式细胞术（Flow cytometry,FCM）观察血小板CEACAM5在蛋白质水平及细胞水平的表达情况;采用双色全血流式细胞术观察ACS患者和正常对照组血小板CEACAM5的表达情况;采用三色全血流式细胞术观察ACS患者血小板CEACAM5和CD62P表达情况;采用液相芯片技术检测ACS患者血清CEACAM5的表达情况;采用血小板聚集仪观察CEACAM5胞外段蛋白（rhCEACAM5）对凝血酶、胶原、花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）等激动剂诱导的血小板聚集的影响;采用流式细胞术观察rhCEACAM5对凝血酶、胶原活化血小板后P-选择素释放的影响;在显微镜下观察rhCEACAM5对血小板在固化胶原上粘附功能的影响;采用体外酶切实验观察MMP-2、-7、-9、-12对rhCEACAM5的剪切情况。[结 果]1.CEACAM5在人血小板上的表达情况1)采用WB及FCM在蛋白质及细胞水平确认血小板可表达CEACAM5;2)采用FCM发现,经凝血酶刺激血小板活化后,血小板CEACAM5表达水平较静息血小板显著升高（P<0.01）。2.ACS患者血小板CEACAM5的表达情况及其与血清CEACAM5水平、心肌坏死标志物和BNP的相关性研究1)ACS患者血小板CEACAM5水平显著高于正常对照组（P<0.01）;2)ACS患者血小板CEACAM5水平与血清CEACAM5水平未见明显相关性（P>0.05）;3)ACS患者血小板CEACAM5水平与cTnI、CKMB、MYO未见明显相关性（P>0.05）;4)ACS患者血小板CEACAM5水平与BNP呈显著正相关（P<0.05）。3.血小板CEACAM5水平对ACS的预测和诊断价值1)ACS患者血小板CEACAM5水平不受性别、年龄、心血管危险因素和cTnI影响,可能是ACS的独立危险因素（P<0.01）;2)经ROC曲线验证,血小板CEACAM5水平可用于诊断ACS,具有较高的敏感性（88.7%）和特异性（75%）,且血小板CEACAM5水平与cTnI检测联合后较单独cTnI检测敏感性显著升高,由60%升高至93%,而特异性有所降低,由95%降至75%（P<0.01）;3)ACS患者血小板CEACAM5水平和CD62P水平呈正相关（P<0.01）。4.rhCEACAM5对血小板活化作用的影响4.1 rhCEACAM5对多种激动剂诱导的血小板聚集的影响1)rhCEACAM5可抑制低剂量凝血酶诱导的血小板聚集（P<0.01）,且呈剂量依赖型,5 μg/ml和10 μg/ml的rhCEACAM5对血小板聚集抑制率分别达70%和 94%;2)rhCEACAM5可抑制低剂量胶原诱导的血小板聚集（P<0.01）,且呈剂量依赖型,10 μg/ml的rhCEACAM5对血小板聚集抑制率可达78%;3)rhCEACAM5对高剂量凝血酶、胶原,以及AA诱导的血小板聚集均未见明显作用（P>0.05）。4.2 rhCEACAM5对血小板P-选择素释放及血小板-胶原粘附作用的影响1)rhCEACAM5可明显抑制凝血酶诱导的血小板P-选择素释放（P<0.01）,且呈剂量依赖型,2、5和10μg/ml的rhCEACAM5对P-选择素释放抑制率分别达 28%、40%和 53%;2)rhCEACAM5对胶原诱导的血小板P-选择素释放未见明显影响（P>0.05）;3)2、5、10 μg/ml的rhCEACAM5对血小板粘附于胶原基质未见明显作用（P>0.05）。5.MMP-2、-7、-9、-12对CEACAM5胞外段的体外酶切反应将 rhMMP-2、-7、-9、-12 与 rhCEACAM5 在 37℃共孵育后,未发现rhCEACAM5条带减弱现象,也未发现多余的蛋白质片段。[结论]1.人血小板可表达CEACAM5,其表达量与凝血酶诱导的血小板活化有关;2.血小板CEACAM5水平在诊断ACS时具有较高的敏感性和特异性,且与cTnI联合后可显著提高cTnI对ACS诊断的敏感性,但特异性有所降低;3.ACS患者血小板CEACAM5水平不受性别、年龄、心血管危险因素和cTnI影响,可能是ACS的独立危险因素;4.血小板CEACAM5水平与BNP显著相关,可能用于预测心功能;5.血小板CEACAM5水平与血小板P-选择素释放显著相关,可能用于预测血小板活化;6.rhCEACMA5可抑制低剂量凝血酶诱导的血小板聚集以及血小板P-选择素释放,同时也可抑制低剂量胶原诱导的血小板聚集,且呈剂量依赖型;7.MMP-2、-7、-9、-12可能不能剪切CEACAM5胞外段。第二部分 多肽KM17对血小板活化作用的研究[目 的]与CEACAM5高度同源性的癌胚抗原相关粘附分子1（CEACAM1）也可表达于人血小板。虽然,第一部分研究发现MMP-2、-7、-9、-12可能不能通过剪切CEACAM5胞外段生成活性成分,从而影响血小板功能;而本课题组前期研究发现,血小板CEACAM1经血小板活化后分泌的MMP-12剪切后可生成多个活性片段,其中多条片段可影响胶原途径的血小板功能,且均源自Ig C2或IgV样结构域,而对两结构域连接处多肽对血小板活化作用的影响尚不明确。本研究旨在探索含CEACAM1 IgV和IgC2结构域氨基酸序列的多肽KM17对血小板聚集、释放、粘附功能的影响。[方 法]采用血小板聚集仪观察KM17对凝血酶、胶原、AA、二磷酸腺苷（Adenosinediphosphate,ADP）等激动剂诱导的血小板聚集的影响;采用流式细胞术观察KM17对ADP激活血小板后P-选择素释放的影响;在显微镜下观察KM17对血小板在固化胶原上粘附作用的影响。[结 果]1.KM17对多种激动剂诱导的血小板聚集的影响1)KM17能显著促进ADP诱导的血小板聚集（P<0.05）,且呈剂量依赖型,50和100μM的KM17对血小板聚集促进率分别为31.4%和66%;2)KM17（10-100 μM）对AA、胶原以及凝血酶诱导的血小板聚集均未见明显影响（P>0.05）。2.KM17对血小板P-选择素释放及血小板-胶原粘附作用的影响1)KM17对ADP激活血小板后P-选择素释放水平未见明显影响（P>0.05）;2)KM17对血小板静态粘附于胶原基质未见明显作用（P>0.05）。[结 论]1.多肽KM17可明显促进ADP诱导的血小板聚集,且呈剂量依赖型;2.多肽KM17对ADP活化血小板后P-选择素释放以及血小板-胶原静态粘附未见明显作用。第三部分 荧光多肽底物Site 84对MMP-2、-7、-9、-12酶活性检测的研究[目 的]本课题组前期研究发现,血小板CEACAM1胞外段经MMP-12剪切后可生成多个活性片段,即意味着CEACAM1胞外段氨基酸序列中可能存在多个MMP-12酶切位点,而包含MMP-12酶切位点合成的多肽有望用于MMPs酶活性的检测。本研究旨在探索CEACAM1源性多肽合成的荧光底物Site 84对MMP-2,-7,-9,-12酶活性的检测,以及探讨与MMP-12同为MMPs家族成员的MMP-7对CEACAM1胞外段（rhCEACAM1）的酶切情况。[方 法]采用荧光酶学法观察荧光多肽底物Site 84对MMP-2,-7,-9,-12酶活性的检测;采用体外酶切实验观察MMP-7对rhCEACAM1的剪切情况。[结 果]1.荧光多肽底物Site 84对MMP-2、-7、-9、-12酶活性的检测1)以Site 84为底物,可获得MMP-12、-7、-2的酶活力曲线,但未获得MMP-9的酶活力曲线;2)以Site 84为底物,可特异性检测明胶酶谱中MMP-2的酶活性,且酶促反应动力学参数:Km=315μM,Kcat/Km=2565 M-1.S-1;2.MMP-7对CEACAM1胞外段（rhCEACAM1）的剪切情况将rhMMP-7与rhCEACAM1在37℃下共孵育后,可发现rhCEACAM1被降解,且呈剂量依赖型,在10kDa左右可见明显条带。[结 论]1.以Site 84为底物,可获得MMP-12、-7、-2的酶活力曲线;2.以Site 84为底物,可特异性检测MMPs明胶酶谱中MMP-2的酶活性;3.MMP-7可能与MMP-12一样,也可剪切CEACAM1胞外段。