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[目的]线粒体核糖体蛋白(mitochondrial ribosomal proteins MRPs)是线粒体复合体结构和功能完整性的必要组成部分,既往对MRPs的认识多停留在其与线粒体相关疾病的关系,新近研究表明,MRPs在多种恶性肿瘤发生发展中发挥重要作用。MRPL47(mitochondrial ribosomal protein L47)是MRPs家族成员之一,是儿童急性淋巴细胞白血病中长春新碱诱发的周围神经病的新高危因素,但其在肺癌及其他实体瘤中的研究尚未见报道。本课题旨在分析MRPL47在非小细胞肺癌发生发展中的作用,并探讨其在非小细胞肺癌中发挥生物学功能的分子机制。[方法]1、检测MRPL47在非小细胞肺癌的表达差异及与临床病理参数的关系1)利用TCGA数据库分析MRPL47在多种恶性肿瘤组织与正常组织的表达差异;2)利用TCGA数据库分析MRPL47在肺鳞癌、肺腺癌和正常组织中的表达差异;3)采用Kaplan-Meier生存曲线分析MRPL47表达对患者预后的影响;4)通过IHC技术检测MRPL47在临床肺腺癌、肺鳞癌及癌旁组织中的表达差异;5)统计学方法分析MRPL47的表达水平与肺癌患者临床病理参数的关系。2、研究MRPL47在非小细胞肺癌中的生物学功能1)细胞株鉴定无误后,利用Western blotting检测MRPL47在多种肺癌细胞系中的表达情况;2)利用慢病毒感染非小细胞肺癌细胞,荧光拍照检测病毒感染率;3)western blotting实验检测慢病毒感染后各组中MRPL47的敲减效果;4)MTS实验检测MRPL47对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响;5)平板克隆实验检测MRPL47对非小细胞肺癌细胞克隆能力的影响;6)Transwell实验检测MRPL47对非小细胞肺癌细胞转移能力的影响;7)流式细胞周期检测MRPL47对非小细胞肺癌细胞周期的影响。3、研究MRPL47在裸鼠体内对非小细胞肺癌增殖的影响1)裸鼠皮下成瘤实验检测敲减MRPL47后对肺癌细胞在体内生长能力的影响,观察测量裸鼠成瘤体积生长速度;2)剥离瘤体组织进行HE和IHC染色,检测MRPL47敲减情况和Ki-67蛋白表达情况。4、探索MRPL47促进非小细胞肺癌增殖的分子机制1)生物信息学软件预测与MRPL47的可能互作蛋白;2)Co-IP检测MRPL47与LAMTOR3之间相互作用;3)Western blotting 检测 MRPL47 对 LAMTOR3/mTOR/MAPK 信号通路的影响;4)Western blotting检测MRPL47对周期蛋白的影响。[结 果]1、MRPL47在NSCLC组织标本中的表达高于癌旁组织1)TCGA数据库中分析显示,MRPL47在多种癌组织中表达高于正常组织(P<0.05);2)TCGA数据库中分析显示,MRPL47在肺腺癌及肺鳞癌中的表达均明显高于正常组织(P<0.05),且在肺鳞癌中的表达高于肺腺癌;3)Kaplan-Meier生存曲线分析显示,MRPL47阳性患者的总生存期明显低于MRPL47阴性患者;4)IHC检测结果显示,MRPL47在肺鳞癌、肺腺癌组织中的表达高于癌旁组织的表达(P<0.05);5)统计分析结果显示,MRPL47在肺鳞癌、肺腺癌中的表达与肿瘤T分期及AJCC分期密切相关。2、MRPL47在非小细胞肺癌恶性增殖中发挥重要作用1)Western blotting检测结果显示,MRPL47在肺腺癌细胞系A549、SPC-A-1、PC-9及肺鳞癌细胞系H226中的表达均高于正常肺支气管上皮细胞系BEAS-2B和正常肺泡上皮细胞系16-HBE,选择表达相对高的肺腺癌细胞系A549及肺鳞癌细胞系H226作为研究对象;2)利用慢病毒敲减A549和H226内源性MRPL47,荧光拍照显示感染率均在80%以上;3)Western blotting 结果显示,慢病毒序列shMRPL47-1和shMRPL47-2均可显著敲减肺腺癌细胞系A549及肺鳞癌细胞系H226内源性的MRPL47;4)MTS细胞增殖实验结果显示,敲减肺腺癌细胞系A549及肺鳞癌细胞系H226的MRPL47后,细胞增殖能力显著降低(P<0.05);5)克隆形成实验显示,敲减肺腺癌细胞系A549及肺鳞癌细胞系H226的MRPL47后,细胞克隆能力显著降低(P<0.05);6)Transwell实验结果显示,敲减肺腺癌细胞系A549及肺鳞癌细胞系H226的MRPL47后,细胞转移能力明显下降(P<0.05);7)流式细胞周期结果显示,敲减肺腺癌细胞系A549及肺鳞癌细胞系H226的MRPL47后,细胞周期阻滞于G2期(P<0.05);3、MRPL47在体内环境可促进肺癌细胞的生长1)慢病毒敲减肺腺癌细胞A549的MRPL47后,A549在BALB/c裸鼠体内的生长速度明显降低(P<0.05);2)处死裸鼠,敲减MRPL47的瘤体湿重明显低于scramble组(P<0.05);3)移植瘤组织类型确定为肺腺癌;4)敲减MRPL47的裸鼠肿瘤组织中MRPL47和细胞增殖指数Ki-67的表达明显低于未敲减组。4、MRPL47通过激活LAMTOR3调节mTOR和MAPK通路促进肺癌细胞生长1)生物信息学软件预测结果显示,MRPL47与LAMTOR3可能存在互作关系;2)Western blotting结果显示,MRPL47表达被抑制后,LAMTOR3表达也受到抑制;3)CO-IP结果显示,MRPL47与LAMTOR3为相互作用蛋白;4)慢病毒抑制非小细胞肺癌细胞的MRPL47表达后,mTOR和ERK通路蛋白表达降低,P38通路蛋白表达升高(P<0.05);5)慢病毒抑制非小细胞肺癌细胞的MRPL47表达后,细胞周期调控相关蛋白P21、CDK1和cyclin B表达下降(P<0.05)。[结论]MRPL47通过调控LAMTOR3激活mTOR和MAPK信号通路在非小细胞肺癌恶性增殖中发挥重要作用。