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猪繁殖与呼吸道综合症(PRRS)是一种在猪身上发生的烈性传染病,我国将它划分至一类传染病,患病母猪主要导致死胎、流产、木乃伊胎等繁殖障碍,病原为猪繁殖与呼吸道综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(NA-type PRRSV)及其变异毒株在我国流行已经有数十年之久,传播至各个地区。但近年来的有流行病学调查的数据表明,我国部分地区有检测到欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(EU-type PRRSV),这两种病毒不发生交叉保护但可以混合感染并且病毒可以实现重组。因此,蓝耳病的预防不仅要对之前就广泛流行的美洲型PRRSV进行控制,同时又要预防新传入的欧洲型PRRSV。本实验室主要针对近两年来我国华南地区PRRSV的流行情况进行了病原的流行病学调查研究,获得了9株阳性样品。选取3株毒株进行RT-PCR扩增,并对ORF5基因进行遗传变异分析。利用PAMs细胞成功分离了一株欧洲型PRRSV命名为PRRSV CN-2016。PRRSV的ORF5阅读框在所有开放阅读框中基因变异最明显,通过核苷酸序列对比显示欧洲型与美洲型ORF5基因同源率仅为55%~70%。本研究根据PRRSV的基因序列比对核苷酸差异性使用简并碱基设计并合成两对引物,对应的欧洲型和美洲型毒株PCR产物分别为1296bp和198bp,引物命名为EU-ORF5和NA-ORF7。经过反应条件的优化和大量样品的检测分析,成功建立鉴别欧洲型和美洲型PRRSV的PCR分别检测方法。利用该方法检测广东省2015~2017年采集的来自不同地区的310份疑似PRRS的肺部及淋巴结病料,PRRSV平均阳性率达到28%,欧洲型PRRSV检测出9份阳性率为2.9%。在所有PRRSV阳性病料中欧洲型PRRSV占了10.4%。毒株同源性分析所选取的三个毒株与在欧洲地区(荷兰、丹麦、比利时、西班牙)分离的10个毒株(LV4.2.1、LV、Lena、MLV-DV等)之间的核苷酸同源性为82.8%~88.9%。遗传进化树分析显示,3株PRRSV毒株均位于G2组,同为G2组毒株分别来自比利时和中国,提示这些在中国大陆流行的毒株可能来源于比利时。将检测为阳性的3株检测基因型为欧洲PRRSV的毒株经离心并除菌过滤,接种于制作好的猪肺泡巨噬细胞上,连续进行盲传。传至第3代时出现细胞聚集皱缩等细胞病变,最终成功将其中一株欧洲型PRRSV毒株CN-2016分离并稳定传至第6代。根据GeneBank中PRRSV代表毒株设计简并碱基(包含部分ORF4和ORF6基因)的引物,利用RT-PCR方法从细胞培养物中扩增大小约1296bp片段,克隆入pMD18-T载体后进行测序分析,表明分离株与13V117和Lena等比利时毒株进化树处于同一分支,核苷酸同源性为86.8%和82.4%,分离毒株可能来源于比利时。本研究显示中国大陆有欧洲型PRRSV入侵,我国广泛使用的美洲毒株疫苗对欧洲型PRRSV的交叉保护力弱,因此在疾病防控策略上需要引起进一步思考。