【摘 要】
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大电导钙激活钾离子通道（Large conductance calcium activated potassium channel,BK）位于生物体细胞膜上,对K+具有高通透性,具有被钙离子和膜电压双重激活的特性,在调节细胞兴奋性方面起重要作用。目前,对植物寄生线虫大电导钙激活钾通道的研究比较少,其结构和功能都还未确定。本研究以马铃薯腐烂茎线虫为实验材料,通过基因克隆获得马铃薯腐烂茎线虫大电导钙激
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大电导钙激活钾离子通道（Large conductance calcium activated potassium channel,BK）位于生物体细胞膜上,对K+具有高通透性,具有被钙离子和膜电压双重激活的特性,在调节细胞兴奋性方面起重要作用。目前,对植物寄生线虫大电导钙激活钾通道的研究比较少,其结构和功能都还未确定。本研究以马铃薯腐烂茎线虫为实验材料,通过基因克隆获得马铃薯腐烂茎线虫大电导钙激活钾通道的α亚基slo1基因（Dd-slo1）序列全长。实验结果表明:马铃薯腐烂茎线虫BK通道的α亚基slo1基因c DNA全长为3456 bp,5’UTR为:45 bp;3’UTR为:36 bp;编码1124个氨基酸,Gen Bank的登陆号为MW015082。通过对马铃薯腐烂茎线虫BK通道的α亚基氨基酸序列进行生物信息学分析,获知马铃薯腐烂茎线虫BK通道α亚基与无脊椎动物的具有很高的同源性,其序列中的功能结构域也基本保持一致,在进化过程中高度保守。对其蛋白质结构进行分析,可知马铃薯腐烂茎线虫BK通道α亚基有7个跨膜结构域（S0-S6）,其中,S1-S6是所有电压门控钾通道都具有的跨膜结构域,S0是大电导钙激活钾通道所特有的跨膜结构域,另外还含有S7-S10的疏水性结构域,组成一个大羧基端,也是BK通道特有的结构。将马铃薯腐烂茎线虫BK通道的slo1基因全长编码序列根据哺乳动物密码子的优化性进行优化之后,连接到p IRESneo3质粒上,构建p IRESneo3-Dd-slo1真核表达载体。通过NotⅠ和NheⅠ双酶切鉴定真核表达载体构建成功。通过脂质体转染法将p IRESneo3-Dd-slo1真核表达载体与荧光质粒GFP共转染至HEK 293细胞中,并通过G418抗性筛选出稳定表达p IRESneo3-Dd-slo1的HEK 293细胞系。结果表明:经过G418抗性筛选十四天后,挑选能表达绿色荧光蛋白的细胞进行单克隆细胞培养,在荧光倒置显微镜观察到能表达荧光蛋白的HEK 293单细胞系,根据细胞系荧光蛋白的表达初步确定马铃薯腐烂茎线虫BK通道α亚基基因在HEK 293单细胞系中表达。
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