盆腹腔粘连是子宫内膜异位症(以下简称内异症)最常见的表现之一,是造成内异症患者疼痛、不孕等的常见原因,也是造成手术困难和手术风险升高的重要原因。内异症造成粘连的主要特点包括：1粘连发生率高：80%以上的初治患者存在不同程度的盆腔粘连,而复发性内异症,粘连的机会几乎100%；2粘连程度重：内异症造成的粘连多为致密性的粘连,往往导致盆腔各个器官组织解剖结构不清,手术风险增大；3粘连造成的盆腔解剖变异,可以造成严重的后果如疼痛,不育和包裹性积液；4术后粘连再形成发生率高,使得再次手术的风险进一步增大。内异症粘连形成机制目前尚不明确。因此,研究内异症粘连的发生及其相关因素,对进一步理解内异症的发生机制以及寻求有效的预防粘连的方法将有积极的意义。腹膜由表面的单层间皮细胞及其下的结缔组织构成。正常的腹膜修复过程是：当腹膜受到创伤时,表面的间皮细胞坏死脱落,暴露出结缔组织；局部的炎症反应和血液凝集释放的趋化因子,将损伤部位周围的正常间皮细胞和间皮母细胞新生的间皮细胞,吸引到受损伤的部位,从而在受损伤的腹膜表面形成多个间皮细胞岛；在纤溶作用的促进下,这些间皮细胞进一步分裂、增殖并覆盖受损伤的腹膜表面,完成间皮化,形成新的腹膜。因此,腹膜的损伤愈合包括炎症、凝血、血管化、纤维化、细胞外基质沉积、上皮化和创面挛缩等多个步骤,而周围间皮细胞的增殖对于腹膜修复具有重要作用。上述过程的失衡就会导致损伤修复的障碍,并导致粘连的形成。腹膜间皮细胞、腹腔液及其中多种类型的细胞、细胞因子等构成的腹腔微环境对内异症病灶发生、发展及疾病相关的临床症状具有一定的作用。目前诸多相关研究亦证实了内异症患者腹腔微环境的改变,且认为盆腔内异症发病机制不仅涉及到随经血逆流进入盆腹腔的子宫内膜碎片及其特性的变化,而且还涉及到盆腹腔微环境中的细胞及细胞因子对异位内膜细胞生长产生的相关作用。腹膜间皮细胞在腹膜损伤、修复及粘连形成机制中的具有重要作用。腹膜间皮细胞,对维持腹膜结构完整性及维持腹膜局部纤溶活性起到重要作用,任何因素对腹膜的刺激,引起腹膜间皮细胞的改变均可能导致腹膜粘连的形成。转化生长因子-β(TGF-β)作为一类多功能的细胞因子,具有调节细胞生长分化等多种作用,且与多种纤维病变的发生、发展有关。腹腔液中巨噬细胞、子宫内膜基质细胞等均可产生、分泌TGF-β。哺乳动物的TGF-D有3型,即TGF-β1,TGF-p2,TGF-p3,三者功能相似且互相依赖,其中TGF-β1被认为是参与纤维化形成的主要细胞因子,能够促进细胞外基质中各种成分如胶原蛋白、纤维连接蛋白等合成的增多及促进新生血管的形成。TGF-β1经过活化后与其特异性的细胞表面受体结合,通过胞内信号途径的逐级磷酸化过程启动多种Smad成分,参与组织的纤维化形成。TGF-β1亦是一种强效的炎性趋化因子和免疫抑制物,具有调节细胞生长、诱导及刺激人单核细胞及巨噬细胞趋化,是纤维形成和新生血管形成的诱导物；能够显著抑制T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞功能,具有显著的免疫调节功能,在组织修复过程中是一种重要的细胞调节因子。Oosterlynck等发现内异症患者腹腔液NK细胞活性降低,而腹腔液中TGF-β1水平升高,认为内异症患者腹腔液NK细胞活性降低与TGF-β1活性升高有关,这亦提示TGF-β1与内异症的发生、发展具有一定相关性。近年来我院郎景和教授总负责的课题组对在位内膜在内异症发病机制中的作用进行了系统的研究,取得了一些重大突破：系统的论证了内异症在位内膜在粘附、侵袭、血管形成、致炎性反应等多方面与正常子宫内膜相比,具有诸如超微结构、基因、表达产物和机能状态的差异。因此我们认为内异症患者返流至盆腔的子宫内膜细胞对腹膜间皮细胞产生影响,使得腹膜结构发生异常而影响腹膜正常修复机制,导致腹膜粘连形成。那么内异症和非内异症患者腹膜间皮细胞之间有何功能差异、TGF-β1对腹膜间皮细胞有何作用、雌孕激素对TGF-β1有何影响、TGF-β1中和性抗体的应用能否对异位症病灶的发生、发展及粘连形成有作用,针对以上一系列问题进行以下临床基础研究。研究目的1.探讨内异症患者腹膜间皮细胞与正常腹膜间皮细胞差异。2.探讨TGF-β1对腹膜间皮细胞生长活性及细胞周期影响。3.探讨雌、孕激素对体外培养腹膜间皮细胞TGF-β1、smad3/7表达的影响。4.探讨盆腹腔内异症裸鼠模型中TGF-β1抗体对裸鼠腹腔内异症病灶及粘连形成的影响。研究方法1.体外培养腹膜间皮细胞,并行细胞免疫组化及流式细胞鉴定分析。2.MTT法检测TGF-β1对腹膜间皮细胞生长活性影响：相同浓度TGF-β1、不同作用时间对于腹膜间皮细胞生长活性的影响；不同浓度TGF-β1、同一作用时间对于腹膜间皮细胞生长活性的影响。3.流式细胞技术检测TGF-β1对腹膜间皮细胞周期影响：相同浓度TGF-β1、不同作用时间对于腹膜间皮细胞周期的影响；相同作用时间、不同浓度TGF-β1对于腹膜间皮细胞周期的影响。4.采用细胞免疫组化法、Real time-PCR、Western blot检测雌、孕激素对体外培养腹膜间皮细胞TGF-β1及Smad3、7表达的影响。5.建立盆腹腔内异症裸鼠模型；以TGF-β1抗体作用于内异症裸鼠模型,观察裸鼠内异症病灶及粘连形成情况。结果1.采用侧盆壁肉眼观察正常腹膜组织,体外成功分离、培养内异症腹膜间皮细胞,而正常腹膜间皮细胞不易体外培养；低浓度胰酶、短时消化是获得良好均一性腹膜间皮细胞的适宜处理条件2.TGF-β1对腹膜间皮细胞生长活性具有抑制作用,并表现出浓度依赖性。TGF-β1浓度≤2.5ng/ml时,TGF-β1降低腹膜间皮细胞的活性。TGF-β1>2.5ng/ml时,TGF-β1降低腹膜间皮细胞生长活性的作用逐渐减弱。3.TGF-β1对腹膜间皮细胞的增殖具有抑制作用,并表现出浓度依赖性。TGF-β1浓度至2.5ng/ml时,TGF-β1抑制抑制腹膜间皮细胞增殖作用。TGF-β1>2.5ng/ml时,TGF-β1抑制腹膜间皮细胞增殖的作用逐渐减弱。4.不同浓度雌激素促进腹膜间皮细胞TGF-β1和Smad3、Smad7的表达,具有浓度依赖性。5.不同浓度孕激素能抑制正常腹膜间皮细胞TGF-β1表达,促进内异症组腹膜间皮细胞TGF-β1的表达6.成功建立子宫内膜异位症裸鼠模型；TGF-β1抗体作用于内异症裸鼠模型可以降低裸鼠内异症病灶发生率；但没有明显减轻病灶处粘连形成程度。结论1.对于肉眼观察正常腹膜组织的腹膜间皮细胞,内异症组较对照组体外培养更容易,提示内异症腹膜间皮细胞对体外环境适应性增强。2.TGF-β1抑制腹膜间皮细胞生长活性及细胞周期,提示内异症腹腔环境中的细胞因子对腹膜间皮细胞产生影响,引起腹膜间皮细胞的功能异常,可能是粘连形成中的一个重要的环节。3.不同浓度雌孕激素影响TGF-β/Smad相关蛋白表达,雌激素对腹膜间皮细胞TGF-β1和Smad3、Smad7的表达具有一定的促进作用,而孕激素能够降低正常腹膜间皮细胞TGF-β1的表达,对内异症腹膜间皮细胞TGF-β1的表达具有促进作用,提示激素在内异症粘连形成可能起到重要作用。4.TGF-β1抗体可以降低内异症粘连的发生率；但对病灶粘连程度的减轻没有明显作用,提示TGF-β1可能是内异症粘连形成的早期阶段的启动环节,TGF-β1抗体通过阻断TGF-β1对腹膜间皮细胞活性以及增殖的抑制作用从而可以降低粘连的发生,TGF-β1可能成为在预防内异症粘连中具有临床治疗前景的干预靶点,值得进一步深入研究。