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本论文探索并建立了基于RRLC-MS/MS技术的快速发现与识别药物原型成分和代谢产物的整合性分析方法,并采用该方法开展了抗肿瘤候选新药S-(+)-去氧娃儿藤宁碱(CAT)在正常大鼠与Walker256肿瘤模型大鼠中的代谢特异性及其代谢产物分析研究,在此基础上进一步开展了CAT的药物代谢组学方法研究,旨在获得与CAT药效作用和毒性作用相关的内源性代谢物。通过抗肿瘤候选新药CAT的体内代谢研究,在大鼠尿液中发现了21个代谢产物及药物原型,并寻找到在正常大鼠与Walker256肿瘤模型大鼠中具有明显差异的1个特异性代谢产物。此外,在药物代谢组学研究中,以动物体征变化趋势为依据,考察药物引起的内源性代谢物变化信息,筛选出3个与CAT药效作用相关的内源性代谢物和2个与CAT毒性作用相关的内源性代谢物。通过上述研究,获得了抗肿瘤候选药物CAT在正常与肿瘤模型大鼠中代谢差异及其差异代谢产物,以及与药物毒性、药效作用相关的内源性代谢物信息,为抗肿瘤新药CAT的成功研发获得了关键的体内代谢转化信息,并为其作用机制研究提供了有效依据。本论文的研究内容主要包括以下4个部分：1.基于RRLC-MS/MS技术的药物体内代谢产物整合性分析方法研究本研究基于RRLC-MS/MS技术,将能量相关二级质谱扫描(MSE)与多时间段子离子扫描(mpMS/MS)扫描方式以及数据挖掘方法有效整合起来,建立了一种快速发现与识别药物原型成分和代谢产物的新型整合性分析方法。本分析方法采用MSE与mpMS/MS相结合的质谱数据采集方式,并采用特征离子精确质量数提取(hcXIC)方法进行数据挖掘,实现了从复杂生物样本中全面、快速地筛查出药物原型成分和代谢产物的目的。其中,非目标性扫描模式MSE可用一个“普适性”方法对多个目标化合物进行同步分析,保证方法的高通量和高效性；而目标性扫描方式mpMS/MS对MSE发现的可能代谢产物进行进一步识别与验证,保证方法的专属性和灵敏度。mpMS/MS与MSE模式的整合可形成优势互补、相辅相成的分析手段,即MSE为mpMS/MS提供保留时间和分子量信息,有助于实现其高通量；而mpMS/MS则解决了MSE共流出组分干扰的问题。此外,hcXIC数据处理方法采用精确质量数与特征离子相结合的双重过滤数据挖掘模式,能够有效去除内源性物质的干扰,快速筛查出药物代谢产物,尤其利于痕量代谢产物的发现。2.抗肿瘤候选新药CAT在正常大鼠与Walker256肿瘤模型大鼠尿液中的代谢特异性研究本研究采用上述整合性RRLC-MS/MS分析方法,开展了抗肿瘤候选新药CAT在正常大鼠与Walker256肿瘤模型大鼠尿液中的代谢特异性研究。通过系统考察CAT在正常大鼠与Walker256肿瘤模型大鼠的代谢差异以及不同给药剂量下代谢产物的变化情况,寻找CAT在肿瘤模型大鼠中的特异性代谢产物。研究发现CAT在大鼠体内不稳定,容易转化为代谢产物形式,在大鼠尿液中共发现了21个代谢产物及药物原型,其中包括9个Ⅰ相代谢产物和12个Ⅱ相代谢产物。进一步根据菲骈吲哚里西啶生物碱的质谱裂解规律和代谢产物的MS/MS谱分析,分析推导出9个代谢产物的可能结构,并结合NMR数据进行验证与确认,最终确定了3个代谢产物的结构。此外,在高、中、低不同给药剂量下,发现正常大鼠与Walker256肿瘤模型大鼠尿液中的药物代谢产物的含量随着CAT给药剂量的增加而升高。通过对CAT在正常大鼠与Walker256肿瘤模型大鼠尿液中代谢产物的比较分析,发现差异代谢产物M10在肿瘤模型大鼠尿液中的含量明显高于正常大鼠,对此结果进行考察与分析,提出产生这种差异的原因可能是肿瘤形成过程中大鼠体内生物环境发生变化所致。3.基于Walker256肿瘤模型的代谢组学研究本研究基于前期建立的代谢组学分析方法,并且为了使不同样品之间具有可比性,采用更加合理的峰面积归一化与尿液体积相结合的数据校正方法,并利用多变量统计分析和内源性小分子代谢物的动态变化趋势信息,开展了大鼠Walker256肿瘤的代谢组学研究,结果共获得了29个与Walker256肿瘤发展紧密相关的生物标志物。然后通过高分辨MS谱和MS/MS谱数据分析推断其结构,并结合代谢物数据库检索、标准品比对等手段对鉴定结果进行确认。截止目前共鉴定出其中7个生物标志物的结构,包括L-肉碱和乙酰肉碱、胞苷、2’-脱氧胞苷、次黄嘌呤、尿刊酸和肌酸。4.抗肿瘤候选新药CAT的药物代谢组学研究目前药物疗效和毒性评价多使用生理、生化指标等方法,它们可以反映药物作用的结果,但是难以确定药物在体内的作用过程,以及药物结构与药效及毒性作用的明确关系。因此,有必要建立一种药物体内整体分析的新方法,考察药物引起的内源性代谢物的变化动态,并为药物的药效及毒性的预测提供物质基础。本研究通过动物体征变化考察药物的药效及毒性作用,采用代谢组学的研究思路分析药物引起的内源性代谢物的变化差异,然后将动物体征变化与代谢物变化进行关联性研究,寻找与药物毒性作用和药效作用有关的内源性代谢物。首先,通过对正常大鼠和Walker256肿瘤模型大鼠的体重、存活期等体征进行分析考察,结果表明CAT在正常大鼠中仅表现为毒性作用,并且具有剂量依赖性；而在肿瘤模型大鼠中表现为药效和毒性双重作用,其中低、中剂量的CAT在大鼠体内药效作用大于毒性作用,高剂量的CAT在大鼠体内毒性大于药效作用。其次,采用多变量数据处理方法,开展了正常大鼠高、中、低剂量给药组与对照组之间内源性代谢物的差异分析,并结合大鼠体征变化,获得了2个与CAT毒性相关的内源性代谢物；采用相同的方法对Walker256肿瘤模型大鼠高、中、低剂量给药组与对照组进行分析,获得了3个与CAT药效相关的代谢物。从而,为全面且深入了解抗肿瘤候选新药CAT的药效及毒性作用获得了关键的体内信息。