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一、研究背景及目的前列腺癌(prostate cancer,PCa)是中、老年男性常见的泌尿系统恶性肿瘤。随着以前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)筛查代表的前列腺早期筛查技术在全球的推广,近二十年来,前列腺癌的发病率不断上升,最近的研究显示,在全球男性癌症中,前列腺癌的发病率和病死率已分别居第二位和第六位。在美国,前列腺癌的发病率位居男性恶性肿瘤之首,病死率仅次于肺癌,是40岁以上男性癌症第二位死因。近年来,随着中国社会老龄化程度的加剧、国民健康体检意识的增强以及肿瘤检测技术的提高,伴随人们居住环境和生活习惯的改变,前列腺癌的发病率呈逐年递增趋势。因此,近年来针对前列腺癌发生、发展的分子机制和临床上如何早期诊断、治疗、判断预后的研究已经成为全球泌尿外科的重点研究领域之一。目前,以前列腺癌根治术为代表的手术切除方式是治疗局限性前列腺癌最有效的方法之一,然而对于诊断为进展期前列腺癌:高血清PSA值,高Gleason评分、且发生局部或远处转移,和局限性前列腺癌根治术后出现生化复发或远处转移的患者,首选治疗方案是内分泌治疗。内分泌治疗又称雄激素剥夺治疗对雄激素依赖型前列腺癌疗效确切,但雄激素剥夺治疗中位有效时间仅为14-28月,几乎所有患者最终都将发展为雄激素非依赖前列腺癌(AIPC)而对雄激素剥夺治疗不敏感,对于这类病人,目前缺乏能有效控制病情的治疗方案。TPD52L2分子又称TPD54/D54,是肿瘤蛋白家族D52(tumor protein D52,TPD52)的成员之一。TPD52家族是在研究乳腺癌中差异表达的基因时第一次被发现。该家族蛋白的特征结构是N端具有相类似的双股卷曲螺旋结构(coil-coiled motif)。TPD52家族最重要的生理功能是参与Ca2+依赖的膜泡运输过程的调节。同时研究显示,该家族成员蛋白在非精原细胞癌、精原细胞癌、导管和小叶型乳腺癌、肝细胞癌、口腔鳞癌等多种肿瘤组织中过量表达,提示TPD52家族可能在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。TPD52L2作为家族的新成员,定位于20q13.2-q13.3。近年来,脑胶质瘤细胞研究提示:敲减TPD52L2分子可以抑制细胞生长和克隆形成并将细胞阻滞在G0/G1期。在口腔鳞癌细胞中,敲减TPD52L2同样能抑制细胞生长并促进凋亡,然而在前列腺癌组织和细胞中,关于TPD52L2的研究尚无人报道。研究目的:探讨TPD52L2在前列腺癌组织中的表达水平与患者预后的关系,及与已知临床预后因素的相关性;建立TPD52L2表达沉默的激素非依赖性前列腺癌细胞模型,研究TPD52L2对激素非依赖性前列腺癌细胞的细胞功能和生物学行为的影响,并探索其可能发挥作用的分子机制。二、研究方法、结果(一)前列腺癌临床标本TPD52L2表达水平检测和患者预后分析我们收集了长征医院泌尿外科2010-2012年117例接受前列腺癌根治术患者的临床信息和组织标本及术后随访信息。前列腺癌患者临床信息包括患者诊断时年龄、术前PSA、术后病理分期、Gleason评分、病理T分期、包膜侵犯、切缘阳性、周围神经侵犯和精囊侵犯等。所有肿瘤相关组织标本分为癌和癌旁两部分,每部分各分两份分别放液氮和福尔马林浸泡保存。术后随访信息包括生化复发时间。我们采用免疫组化、q PCR方法对所有组织标本进行TPD52L2表达水平检测,并与患者临床和预后信息做相关性分析,结果提示:相对于前列腺癌旁组织,前列腺癌组织中TPD52L2表达水平明显升高,并与术后Gleason评分呈正相关;生存分析提示:相对于TPD52L2高表达患者,低表达患者无生化复发时间具有明显优势。多因素分析提示:TPD52L2表达量、Gleason评分和病理T分期是前列腺癌患者生化复发的独立预后因素。(二)构建激素非依赖性前列腺癌细胞株TPD52L2敲减模型作为前期准备工作,我们检测了各种前列腺癌细胞系中TPD52L2的表达水平,确定相对高表达TPD52L2并且恶性程度较高的DU145和PC-3两株细胞系作为我们的实验对象,并用已经构建好的靶向沉默TPD52L2基因的sh RNA慢病毒对这两株前列腺癌细胞进行感染,观察并记录慢病毒自身荧光报告基因(GFP)表达情况,然后分别利用q PCR技术和蛋白印记(western blot)对TPD52L2基因的敲减效率进行m RNA和蛋白水平的检测,结果提示sh RNA慢病毒载体明显下调了DU145和PC-3细胞中TPD52L2的表达。(三)沉默TPD52L2基因对激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3和DU145的增殖和克隆形成能力、细胞周期及细胞迁移能力的影响本实验环节,我们应用已构建的TPD52L2稳定下调的激素非依赖性前列腺癌细胞株模型,研究TPD52L2对激素非依赖性前列腺癌细胞功能和生物学行为的影响。在已确定通过Lv-sh RNA成功下调TPD52L2表达水平的PC-3和DU145前列腺癌细胞株中,进行MTT细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞周期分析实验和细胞迁移实验。和对照组Lv-sh CON转染的细胞相比,Lv-sh TPD52L2转染的两株细胞系的生长明显受到抑制、克隆形成能力下降、细胞迁移能力下降,差异均有统计学意义。并且在DU145细胞系中,Lv-sh TPD52L2转染细胞出现S期阻滞现象。三、结论通过以上实验,我们得出结论如下:TPD52L2在前列腺癌组织中过量表达,与Gleason评分呈正相关,并且是前列腺癌根治术患者术后生化复发的独立预后因素。进一步体外细胞实验提示,沉默TPD52L2的表达可抑制激素非依赖性前列腺癌细胞的相关肿瘤生物学功能及特性,说明TPD52L2在肿瘤发生和进展及激素非依赖表型转化中可能发挥重要作用,并有望成为前列腺癌的预后指标和治疗雄激素抵抗型前列腺癌的一种新的靶向分子。