肉毒毒素（botulinumneurotoxin,BoNT）是一类由革兰氏阳性厌氧的肉毒梭菌在适宜条件下分泌的蛋白类神经毒素,是已知毒性最强的细菌毒素之一,按照血清型的不同分为A-G七种,其中A型肉毒毒素（BoNT/A）毒性最强也最为常见。至今未有化学类药物可以有效治疗肉毒毒素中毒,现今临床上常采用马血清进行治疗,但马血清容易污染、制备周期长、产率不稳定,而且作为异源物质容易引发超敏反应,不能成为常备药物。因此,单克隆抗体的研制成为近年来BoNT中毒治疗的主要研究方向。本实验室开展了肉毒毒素预防和治疗药物的研发,前期筛选得到了60余株针对A型肉毒毒素的单抗,其中1F11、2D2、6B3三种抗体联合使用的情况下对A型肉毒素中和活性可达1000 LD50/mg。并初步确定1F11、2D2和6B3与毒素对应的抗原表位分别位于HCC、HCN、和LHN上。本研究的目的是在前期研究的基础上制备1F11、2D2、6B3单克隆抗体,进而检测抗体与BoNT/A结构域之间的亲和力常数并建立ELISA方法检测抗体浓度,用以药代动力学研究。首先进行抗原蛋白的制备。抗原蛋白包含两部分,第一部分是BoNT/A结构域HCC、HCN、HC、LHN蛋白的制备。将pTIG-HCC、pTIG-HCN、pTIG-HC、pTIG-LHN分别转化进入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后得到HCC、HCN、HC、LHN重组蛋白。重组蛋白经亲和层析柱纯化后用Gelpro Analyzer软件分析,纯度均在90%以上。第二部分是全长BoNT/A蛋白的制备。本研究采用srtA连接法制备全长BoNT/A蛋白。srtA是一类来自黄金葡萄球菌的转肽酶,可以将含有LPETG与Gly-Gly-Gly-（简称G-）序列的蛋白质连接在一起。通过PCR扩增G-HC、LHN-LPETG（Thrombin）、srtA基因,PCR产物克隆进pTIG质粒构建pTIG-G-HC、pTIG-LHN-LPETG（Thrombin）重组表达载体。构建成功后分别转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中表达重组蛋白G-HC、LHN-LPETG（Thrombin）、srtA。利用Gelpro Analyzer软件分析亲和层析柱纯化后的蛋白,纯度均在90%以上。利用srtA连接法获得全长BoNT/A,通过Thrombin酶切全长BoNT/A获得具有完整结构的BoNT/A,经SDS-PAGE与Western Blot鉴定可见与预期蛋白大小相符的清晰条带。将制备的BoNT/A以腹腔注射小鼠的方式评价毒力,结果显示制备的BoNT/A抗原具有活性且经Thrombin酶切后毒力进一步增强。其次进行抗体的制备,通过HEK-293F细胞表达系统制备1F11、2D2、6B3抗体。将前期构建完成的抗体轻链、重链表达载体瞬时转染到HEK-293F细胞内进行表达。通过SDS-PAGE鉴定纯化后的抗体,经Gelpro Analyzer软件分析,纯度均在90%以上。采用BIAcore检测1F11、2D2、6B3抗体的亲和力常数,结果如下:1F11与HC之间亲和力常数为1.378×10-12、2D2与HC之间亲和力常数为7.094×10-11,2D2与HCN之间亲和力常数为1.256×10-8、6B3与LHN之间亲和力常数为5.615×10-10。最后一部分是建立ELISA检测抗体浓度的方法,用以药代动力学研究。将HCC作为包被底物建立1F11抗体ELISA检测方法;将HC作为包被底物建立检测2D2抗体的ELISA方法;以LHN作为包被底物建立ELISA方法检测6B3抗体。测定各检测方法的标准曲线、线性范围并评价回收率、变异系数（CV%）、灵敏度、血清干扰程度及线性稀释影响。结果如下:1F11检测方法的线性范围为0.5ng/mL-6ng/mL;2D2检测方法的线性范围为3.5ng/mL-25ng/mL;6B3检测方法的线性范围为4ng/mL-20ng/mL。以上检测方法的回收率介于90%-110%,CV%小于15%,具有良好精密度、灵敏度、血清无干扰且线性稀释不影响样品检测。综上所述,本研究制备了BoNT/A各部分结构域蛋白及1F11、2D2、6B3抗体,通过BIAcore检测结构域与抗体间亲和力常数;通过srtA连接法制备全长BoNT/A;建立了检测性能良好的抗体浓度检测方法,为后续药代动力学研究提供基础工具。