肉毒毒素(botulinum toxin, BoNT)是一种烈性外毒素蛋白,由厌氧肉毒梭菌(Clostridium botulinum)在生长繁殖过程中所产生,是目前自然界已知毒性最强的生物物质。由于毒性极强、制备容易等特点,BoNT被认为是最重要的致死性生物战剂和生物恐怖剂,其对社会安全与民众健康的潜在威胁不容忽视。目前,临床有效治疗肉毒中毒的方法是及时给患者注射多价马血清抗毒素,然而在实际应用中受到了很大的限制。因此,发展新的治疗性抗体,具有十分重要的社会和军事意义。本研究的主要目的是获取BoNT重链碳端重组蛋白(AHc和BHc)在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达产物,通过分别免疫来航鸡制备特异性抗体anti-AHc IgY和anti-BHc IgY,并完成鼠模型的被动治疗评价,为IgY抗体应用于肉毒中毒的临床预防和治疗奠定基础。首先,通过分子克隆技术构建载体表达获得目的蛋白AHc和BHc。对两组基因序列大肠杆菌密码子优化,分别构建含有该目的片段的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc、 pTIG-Trx-BHc,经过PCR和酶切鉴定正确后分别转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。经过测序鉴定,所合成的重组基因AHc和BHc均与预期结果一致,其开放阅读框架全长分别为1332bp、1314bp。构建的重组表达质粒pTIG-Trx-AHc、pTIG-Trx-BHc PCR双酶切鉴定结果与预期相符。经过诱导表达条件优化,将构建好的表达菌株BL21(DE3)/pTIG-Trx-AHc、BL21(DE3)/pTIG-Trx-BHc分别在0.3和0.2mol/L IPTG、16℃条件下表达。在此条件下,两种重组蛋白均可以获得可溶性表达占菌体裂解液上清的20%,超声碎菌后的上清溶液分别经过Ni-NTA亲和纯化后,获得纯度可以达到95%以上的目的蛋白AHc和BHc。在Western Blot鉴定实验中,AHc和BHc蛋白可分别与抗天然BoNT/A、BoNT/B马血清抗毒素发生特异性抗原抗体反应。然后,通过四次连续免疫健康母鸡获得高效价的特异性IgY抗体。纯化后的AHc蛋白与等体积的完全弗氏佐剂混合,乳化充分后,按照200μg/只的剂量经分别肌肉多点注射。在首次免疫后每隔两周加强免疫一次,共四次,加强免疫使用等体积的非完全弗氏佐剂与两种目的蛋白混合乳化,免疫剂量和方法与首次相同。首次免疫前一天以及每次免疫后一周采集鸡蛋和血清样本,编号后放入4℃冰箱保存备用。免疫过程中收集到的样品均采用间接ELISA方法进行检测抗体效价；第四次免疫后一周收集到的鸡蛋样品通过水稀释和硫酸铵盐析法从鸡蛋中提取纯化特异性anti-AHc IgY抗体。采用相同的方法制备和纯化anti-BHc IgY抗体。分别四次免疫健康母鸡后,在AHc和BHc实验组收集到的血清和鸡蛋样品中均检测到特异性的抗体。免疫后血清中检测到的抗体效价可达到1：106,而卵黄抗体效价约1：105,并且抗体效价可以稳定保持一个月不下降。最后,测定了纯化获得的anti-AHc IgY和anti-BHc IgY抗体的效价,并在小鼠模型中对中和效果进行了评价。在厌氧条件下培养A型、B型肉毒梭菌,收集的产毒培养基纯化处理,最终分离得到具有生物活性的BoNT/A和BoNT/B毒素。在BALB/c小鼠模型中测定两种天然毒素的半数致死剂量,其中BoNT/A攻毒方式为腹腔注射、BoNT/B为腹腔注射和灌胃注射。为了测定评价anti-AHc IgY抗体的中和活性,3个浓度的IgY(100μg/ml、200μm/ml、400μg/ml)溶液分别与3个浓度的BoNT/A (100×LD50、200×LD50、400×LD50)在明胶-磷酸盐缓冲液体系中等体积预先混合,在37℃恒温水浴箱中孵育30-45min,取0.2ml样品混合物小鼠腹腔注射检测。对注射后的小鼠进行96h观察,每隔6h观察一次,记录小鼠生存状态和死亡情况,生存曲线用Prism5统计学软件绘制。之后,利用相同的动物方法测定anti-BHc IgY抗体的中和活性。4×LD50/i.p. BoNT/B溶液分别与等体积倍比稀释的系列anti-BHc IgY抗体混合腹腔注射检测,4×LD50/i.g. BoNT/B溶液分别与等体积倍比稀释的系列anti-BHc IgY抗体混合灌胃注射检测。在天然BoNT/A攻毒试验,anti-AHc IgY可以在体外预混合后可以有效的中和毒素的活性。其中,40ng的anti-AHc IgY可以抵抗最高剂量为20×LD50天然BoNT/A毒素的攻击,保护率均为100%。在anti-BHc IgY攻毒保护实验中,不同剂量的anti-BHc IgY对天然毒素BoNT/B的中和能力有所不同。实验组小鼠在注射毒素-抗体混合物后,中毒症状相比对照组明显减轻并且生存率也随着anti-BHc IgY抗体含量剂量的增加而增加。在抗体-毒素体外预混的实验基础上,anti-BHc IgY给药途径和BoNT/B攻毒途径不同分别通过不同的途径注射模拟研究IgY抗体在毒素预防和治疗中的作用。首先,通过小鼠实验测定腹腔攻毒时抗体灌胃给药时时间与小鼠生存情况之间的关系。4×LD50/i.g.剂量灌胃攻毒时,过量IgY抗体(10mg/kg)在不同的时间点通过腹腔途径给药。然后,在测定IgY注射时间同小鼠生存情况关系的基础上,进一步测定不同剂量的IgY抗体对BoNT/B毒素中和能力的影响。之后,采用相同的方法分析灌胃攻毒,测定IgY抗体腹腔给药时间和剂量与最终小鼠生存情况之间的关系。通过分析测定灌胃攻毒时抗体腹腔给药时时间、剂量与小鼠生存情况之间的关系,我们发现anti-BHc IgY腹腔注射时间和剂量影响抗体对4×LD50/i.g. BoNT/B的中和能力。在攻毒后1.5h注射anti-BHc抗体后,实验组小鼠中毒症状相比对照组明显减轻。在剂量实验中,注射GPB缓冲液的对照组和低剂量anti-BHc IgY实验组小鼠表现出了经典的肉毒中毒症状,均在36h以内死亡。10和20μg/kg IgY剂量组小鼠的存活时间延长,但不能完全保护小鼠免受4×LD50/i.p.剂量的毒素攻击；随着anti-BHc IgY剂量升高到40和80μg/kg,在4×LD50/i.p的毒素攻击下两组小鼠均全部存活。此外,通过灌胃途径检测anti-BHc IgY对天然毒素BoNT/B的中和能力实验也获得了类似的结果。随着IgY的剂量的增加(从0.2mg/kg到0.4mg/kg),小鼠的存活率也随之升高；当IgY为0.8和1.6mg/kg时可以完全中和BoNT/B的毒素活性。本研究实现了AHc、BHc两种重组蛋白在大肠杆菌系统中的可溶性表达,且保留了良好的抗原性；重组蛋白能够有效刺激健康母鸡发生免疫反应,稳定、大量制备高效价IgY,血清中检测到的抗体效价可达到1：106,而卵黄抗体效价约1：105；在小鼠模型实验中呈现除较好的中和活性,40ng的anti-AHc IgY可以抵抗最高剂量为20×LD50天然BoNT/A的攻击,40μg anti-BHc IgY在4×LD50/i.p的BoNT/B毒素攻击下两组小鼠均全部存活。此外,anti-BHc IgY不仅可以在体外混合中有效中和毒素的活性,还可以在小鼠模拟治疗模型中预防和治疗肉毒中毒,为IgY应用于肉毒中毒治疗奠定了基础。