基因工程(gene engineering)诞生于20世纪70年代,是指在体外将不同来源的基因分子插入病毒、质粒或其他载体分子,构成遗传物质的新组合,然后将其导入到合适的宿主细胞内,从而使得外源基因在其中“安家落户”并能持续稳定的繁殖,以及在新的遗传背景下实现功能表达和产生人类所需要的蛋白质。利用基因工程表达功能蛋白和一些具有重要研究价值的蛋白是基因工程的重要内容,目前利用基因工程表达外源蛋白的研究已经被广泛应用在卫生保健、科学研究和工业等各个不同的领域。外源蛋白的主要表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。每种表达系统有其各自的优点,同时在重组蛋白生产的种类、数量以及操作的简易性和生产成本等方面也有各自的制约。大肠杆菌表达系统是最古老的、应用最广泛的一种原核表达系统。它的优点是人们对它的背景研究最透彻、操作方便、生产成本低和重组蛋白产量高。但它也有明显的缺点,例如缺乏真核系统转录及翻译后的表达修饰加工功能,所生产的蛋白活性差,常以不溶性的包涵体形式表达,且其细胞周质内含有种类繁多的内毒素。酵母表达系统不仅具有原核表达系统生长迅速和表达量高的特点,同时还有蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等的功能。其缺点是在表达外源基因时常常会造成产物蛋白的不均一、降解和信号肽加工不完全等问题。且它只具有真核生物表达系统的部分加工修饰功能,无法加工修饰结构复杂的外源蛋白。昆虫细胞表达系统由于其表达量高且具有比较完善的蛋白翻译后加工修饰功能,正被广泛应用于复杂生物蛋白的生产。但其糖基化的寡糖链与哺乳动物细胞系统有所差别,不能正确的修饰加工复杂哺乳动物蛋白的N-糖基化,且操作繁琐、培养成本较高。相反的,哺乳动物细胞表达系统则很好地克服了上述各载体的缺点,具有非常完善的糖基化修饰功能和折叠机制,可以理想地对表达的蛋白进行翻译后加工、修饰并分泌到细胞外,相对于原核、酶母及昆虫细胞等表达系统,哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白活性更接近于天然蛋白,更适合于各种生物蛋白的表达。因此,哺乳动物细胞表达系统有望成为理想的真核生物蛋白表达系统,尽管其也存在一些缺点,如蛋白表达量低、基因表达调控复杂、花费时间长且成本更高等。外源蛋白的有效表达需要选择合适的表达系统,同时必须考虑蛋白结构复杂程度、技术条件、实验要求等因素。哺乳动物细胞表达系统虽然表达量低,但因其能正确表达出活性接近天然蛋白的结构复杂的外源蛋白,因此成为目前蛋白生产系统发展的主流方向。而哺乳动物细胞表达系统应用于表达外源蛋白的一个关键步骤就是获得一个能稳定高效表达外源基因的克隆。目前将外源基因导入细胞主要有两种方法,一种就是利用化学方法(比如脂质体、磷酸钙、PEI等)或物理方法(例如显微注射、电穿孔等)通过瞬时转染直接将DNA导入细胞；另一种就是利用病毒载体感染介导外源基因进入细胞,如慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等。瞬时转染方法通常表达效率低、成本高且整合基因不稳定,外源基因有可能随细胞分裂而逐渐丢失,目的蛋白的表达时限短暂。而病毒载体如慢病毒载体介导的感染通常表达效率高且外源基因能与细胞基因组发生重组,从而实现目的蛋白的持久、稳定表达。慢病毒载体(Lentiviral vector, LV)是逆转录病毒载体的一种亚型,是在HIV-1病毒基础上改建而来的病毒载体系统,能高效地将目的基因导入动物或人的原代细胞或细胞系中。慢病毒载体基因组是正链RNA,其基因组进入细胞后,能在反转录酶及整合酶的作用下将病毒RNA反转录为DNA并整合到细胞基因组中。整合后的DNA在细胞中转录成mRNA,回到细胞浆中,翻译目的蛋白。慢病毒载体能有效感染并整合到分裂及非分裂细胞中,包括脑细胞、肝细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。慢病毒载体介导的基因表达持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂。目前,病毒载体已成为动物体内及体外表达外源基因的有力工具,慢病毒载体在人类细胞系中已经被成功应用于生产百毫克级别的有活性的外源蛋白。而要利用慢病毒载体在HEK 293T细胞中高效稳定表达外源活性蛋白并以此为工具探索重组蛋白生产技术,建立快速生产平台,我们需要选择一个合适的慢病毒载体,然后利用这个载体携带外源基因在HEK-293T细胞中表达,并检测其表达水平及稳定性。综上,本文分为两部分,第一部分通过比较包含不同表达元件的慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白GFP在HEK-293T细胞中的表达水平及稳定性,筛选一个合适的慢病毒载体。第二部分通过将丙型肝炎病毒(HCV)E1基因克隆到慢病毒表达载体中,并包装成慢病毒感染HEK-293T细胞后筛选单克隆细胞系,并检测E1蛋白表达水平及稳定性来检验这个慢病毒载体表达结构复杂蛋白的能力,探索重组蛋白生产技术,建立快速生产平台。首先我们将包含不同表达元件的5个慢病毒表达载体,分别是包含HS4绝缘子和EF1α启动子的pFIN-EF 1α-GFP-2A-mCherH-WPRE,包含UCOE元件和SFFV启动子的p’HR.cppt.3’1.2kb-UCOE-SFFV-eGFP,包含CMV启动子和P-globin内含子的pTYF-CMV (β-globin intron)-eGFP和分别只包含CMV启动子或EF1α启动子的pTYF-CMV-eGFP和pTYF-EF1α-eGFP,与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞包装病毒并检测病毒滴度,按MOI=1000感染293T细胞后每隔3-5天按1传10的比例连续传代,并利用荧光显微镜和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白在HEK-293T细胞中的表达情况。结果显示慢病毒包装成功,滴度分别为2.8×108、3.7×108、2.5×108、1.0×109、2.5x108病毒基因组/毫升(vg/ml)。病毒感染细胞3天后,在荧光显微镜下都能观察到感染细胞发出荧光,且经传3到5代后细胞的蛋白表达水平达到高峰并持续稳定表达5周以上。感染细胞经传代9周后,细胞状态仍然良好,感染细胞的活细胞率都大于80%。感染5周后细胞荧光率分别为22.7±3.3%、5.8±0.4%、54.1±3.7%、57.6±7.8%和38.7±1.1%；而平均荧光强度分别为6391.7±1030.4、1436.0±1.4、21845.7±1959.0、26596.7±3900和9467.7±134.8。9周后,细胞荧光率分别为27.6±6.9%、5.9±0.2%、76.5±2.0%、91.7±1.7%和38.2±3.9%；平均荧光强度分别为1985.7±67.4、386.5±5.0、12814.7±1703.6、21192±882.7和1664.7±113.4。上述结果显示单独含CMV启动子或包含CMV启动子和β-globin内含子的慢病毒载体介导的GFP在293T细胞中的表达效率最高。含HS4绝缘子和EFla启动子的载体介导的蛋白表达效率并没有比单独含EFla启动子的载体介导的表达效率高；含UCOE元件和SFFV启动子的载体介导的蛋白表达水平明显比其他载体介导的表达水平要低,这提示我们包含CMV启动子的载体可以做为一个理想的慢病毒载体在HEK 293T细胞中高效稳定表达外源活性蛋白。为了进一步验证含CMV启动子的慢病毒在表达外源结构复杂蛋白的能力,我们将HCV　E1基因克隆到慢病毒载体pTYF-CMV-eGFP中得到表达载体pTYF-CMV-E1。经瞬时转染初步鉴定El的表达后,将表达载体与慢病毒包装辅助质粒共转染HEK-293T细胞包装成慢病毒载体,取一定量的LV-E1感染HEK-293T细胞,后用有限稀释法筛选高效表达E1蛋白的单克隆细胞并进行消化传代,通过Western Blot方法检测单克隆细胞系中El蛋白的表达情况。通过上述方法,我们成功构建了含E1基因的慢病毒表达载体pTYF-CMV-E1,并通过瞬时转染HEK-293T细胞初步鉴定E1蛋白的表达,目的蛋白能正常表达并分泌到细胞培养上清中。我们成功包装慢病毒载体LV-E1,并将一定量的病毒感染HEK-293T细胞后,通过感染细胞上清Western Blot鉴定表明重组慢病毒载体成功感染了HEK-293T细胞。后用有限稀释法筛选得到能高效表达E1蛋白的单克隆细胞株,经Western Blot检测表明E1基因在HEK-293T细胞中能持续表达,且经传代9周后,表达水平没有明显降低。