非病毒基因载体介导的siRNA

来源 :辽宁师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xy479977530
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RNA干扰(RNAi)又称基因沉默(gene silence),是由内源性mRNA互补的dsRNA导入细胞之后,引发mRNA降解,抑制此编码的基因表达,发生沉默现象。目前为止,在真菌、动物以及植物当中普遍存在的现象。RNAi有较强的特异性、操作简单而方便、转运效率相对高等优势,所以可应用于基因功能、基因治疗以及药物筛选等方面,并且发挥着非常重要的作用。利用Dicer酶,将把导入的dsRNA切割分解成21到25个不等大小的小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)来阻止某些特定基因的表达。本文综述了基因治疗、基因载体、脂质体、阳离子脂质体与DNA复合物的细胞内化途径、RNAi、siRNA、质粒以及脂质体佐剂研究的基础上,实验选用非病毒载体中的阳离子脂质体C/D和商品化Lipofectamine2000,体外RNAi的研究是利用沉默荧光素酶基因来完成。   主要的实验步骤以及结果如下:   第一,转染Hela细胞时,‘使用阳离子脂质体C/D和Lipofectamine2000运载质粒DNA,观察转染效率;第二,进一步研究阳离子脂质体/siRNA复合物的延滞反应:第三,细胞转运时,用带荧光素酶基因的基因载体,并且通过使用浓一度不同的siRNA进行基因沉默,检测基因表达的水平时,利用酶标仪,获得沉默的结果数据;第四,使用MTT法来检测C/D和Lipofectamine2000的运载与转染实验对细胞所产生的毒性做比较。   结果表明:C/D和Lipofectamine2000均可高效地转运质粒DNA,并且可与siRNA完整结合。在比较低浓度siRNA中,C/D和Lipofectamine2000/siRNA复合物对荧光素酶基因的抑制水平较高,同时对细胞影响小,随着siRNA浓度增加,细胞存活率逐渐减少。阳离子脂质体C比商品化阳离子脂质体Lipofectamine2000沉默率高,但对细胞毒性相对较大。通过优化实验条件,阳离子脂质体可以在较低的siRNA浓度下对目的基因进行高效沉默。
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