研究目的本课题拟以JAKs/STATs通路为切入点,通过观察六味补气胶囊对慢阻肺模型大鼠一般状况、肺组织病理变化、肺功能、炎症因子、JAKs/STATs通路相关蛋白表达等影响,及六味补气胶囊对慢阻肺稳定期肺气虚证患者肺功能、中医证候学评分等影响,验证该方对慢阻肺模型大鼠及慢阻肺稳定期肺气虚证患者的治疗作用,探讨六味补气胶囊对JAKs/STATs通路的调控机制,进而探讨该方剂发挥治疗慢阻肺作用的机制,为中医药临床防治慢阻肺提供实验依据。研究方法实验研究:选取70只SD大鼠,适应性饲养后随机分为正常对照(NC)组、模型对照(MC)组、金水宝(JSB)组、脾氨肽(PAT)组、六味补气胶囊高、中、低剂量(LWBQ low/mid/high)组,共7组,每组各10只;除正常组大鼠外,其余大鼠采用气管内脂多糖滴入加烟熏处理法制作慢阻肺模型。NC组、MC组大鼠予生理盐水,其余组分别给予相应药物灌胃治疗。于给药30 d后观察和检测以下指标:大鼠一般情况、肺功能(FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC)、肺组织病理变化,血清细胞因子(IL-4、IFN-γ、IL-17),免疫印迹法检测肺组织JAKs/STATs通路相关蛋白表达(JAK1/p-JAK1、JAK2/p-JAK2、STAT1/p-STAT1、STAT3/p-STAT3、STAT5/p-STAT5和SOCS1、SOCS3蛋白表达)。临床研究:临床观察六味补气胶囊在慢阻肺稳定期临床治疗中的作用。收集肺气虚型慢阻肺稳定期患者共40人,并将其随机分为两组,观察组及对照组,每组各20人,对照组予以西医基础治疗(主要是长期家庭氧疗、舒利迭吸入等治疗),观察组在对照组的基础上加用六味补气胶囊口服,患者服药治疗2月。于入组时间为观察的起点,分别对治疗前后两组患者肺功能、中医证候学评分变化情况进行观察。根据观察指标以及观察数据的不同分别采用相应的统计学处理方法,其中数值采用均数±标准差表示(SX?)。研究结果实验研究结果:1、通过气管内注射脂多糖、烟熏造模的方法,能够成功构建出慢阻肺模型大鼠。熏烟8天后造模大鼠便出现咳喘及呼吸加深加快等症状表现,熏烟23天后出现喘息明显,喉间痰鸣以及精神萎靡、毛色暗淡等表现。治疗后,NC组无明显阳性症状,大鼠呼吸较规律,精神良好,毛色光泽,体重较前增加;MC组大鼠症状变化不明显,较NC组相比见明显消瘦,且呼吸频率明显高于NC组;JSB组、PAT组、LWBQ low组大鼠治疗后消瘦及呼吸频率均较MC组有所改善。LWBQ mid/high两组组大鼠体重及呼吸频率改善均明显优于MC组。说明大鼠一般情况及营养状况在服用六味补气胶囊后能够改善。2、六味补气胶囊可缓解慢阻肺模型大鼠肺功能及组织病理炎症损伤,抑制炎症细胞因子释放。根据肺功能检查结果,MC组FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC水平较NC组明显降低,提示模型大鼠存在阻塞性通气功能障碍;给药组大鼠经过灌胃给药治疗后肺功能降低情况较MC组明显改善,其中LWBQ high组治疗后更接近于NC组,LWBQ mid组次之,但仍优于MC组;六味补气胶囊不同剂量组间比较,其呈剂量依赖性地增加FEV 0.3、FVC水平。说明药物治疗后可在一定程度上改善模型大鼠肺功能水平,缓解气道阻塞与肺通气功能,但不能逆转COPD气道重塑改变。HE病理可见,JSB组、PAT组、LWBQ low/mid/high各组均可见支气管管腔结构狭小或闭塞,管壁见增厚,可见肺气肿形成,炎性细胞在肺组织浸润聚集,肺泡壁明显变薄,肺泡间隔可见增厚等病理表现。与MC组相比,治疗后各组病理损害程度不一,上述病理表现均有不同程度的改善,不同的治疗方法有助于改善COPD的典型病理特征。LWBQ low/mid/high三组相较于MC组,炎性细胞浸润明显减少,肺泡间隔破坏较少,具有更加完整的柱状上皮细胞。LWBQ三组肺组织条件均优于其他治疗组,包括JSB和PAT组。MC组较NC组炎症细胞浸润显著增多,LWBQ mid/high组相较于MC组,可显著减少炎性细胞浸润数目。MC组大鼠较NC组相比IFN-γ含量显著升高,IL-17水平升高,IL-4含量明显降低,提示慢阻肺模型大鼠体内存在炎症反应可能。药物治疗后与MC组相比,PAT组、LWBQ mid/high组IL-4含量明显升高,LWBQ mid/high组IFN-γ、IL-17含量明显降低。表明六味补气胶囊可能通过调节IL-4表达水平的下调和IFN-γ、IL-17表达水平增高从而达到抑制炎症的作用。3、六味补气胶囊可能通过抑制JAKs/STATs信号通路磷酸化水平,进而达到慢阻肺模型大鼠的治疗作用。采用免疫印迹法(Western blot)检测药物治疗后肺组织JAKs/STATs信号通路相关蛋白表达变化。分析显示,MC组大鼠较NC组,JAK1/p-JAK1、JAK2/p-JAK2、STAT1/p-STAT1、STAT3/p-STAT3、STAT5/p-STAT5蛋白表达水明显增加,SOCS1和SOCS3蛋白表达水平降低。六味补气胶囊治疗后,LWBQ low/mid/high三组大鼠与MC组比较,JAK1/p-JAK1、JAK2/p-JAK2、STAT1/p-STAT1、STAT3/p-STAT3、STAT5/p-STAT5蛋白表达水平均明显降低,SOCS1和SOCS3蛋白表达水平明显升高。这些结果表明,慢阻肺模型大鼠肺组织中JAKs/STATs信号通路的磷酸化水平明显上调,SOCS信号通路表达被抑制。六味补气胶囊治疗后有效的抑制了慢阻肺模型大鼠JAKs/STATs信号通路激活,并促进了SOCS信号通路表达水平。表明六味补气胶囊发挥抗炎及治疗作用,可能与抑制JAKs/STATs信号通路有关或通过激活JAKs/STATs通路的负反馈调节因子SOCS表达,从而抑制JAKs/STATs信号通路磷酸化水平有关。临床研究结果:1、六味补气胶囊可稳定COPD患者肺功能。治疗组治疗前与对照组比较,肺功能指标FEV1具有可比性,但无统计学差异。治疗2月后,治疗组和对照组FEV1水平均高于治疗前,治疗组与对照组比较无统计学差异。2、六味补气胶囊可改善患者临床症状及中医证候积分。治疗组治疗前与对照组比较,中医证候积分有可比性,但无统计学差异。治疗2月后,治疗组中医临床证候积分较治疗前明显降低,对照组中医临床证候积分较治疗前降低,治疗组中医临床证候积分与常规治疗对照组比较下降更为明显。结论1.六味补气胶囊可改善慢阻肺模型大鼠肺功能及组织病理炎症损伤,抑制炎症细胞因子释放;2.六味补气胶囊可能通过抑制JAKs/STATs信号通路磷酸化水平,进而达到慢阻肺模型大鼠的治疗作用;3.六味补气胶囊可稳定慢阻肺患者肺功能,改善患者临床症状及中医证候积分。