[研究背景]肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理过程,是慢性肝病发展成肝硬化甚至肝癌的基础和必经阶段,对其有效的防治仍是医学界的难题。现已公认肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化是肝纤维化的核心环节。肝脏损伤时,HSCs的形态和功能遭受破坏,会转变为肌成纤维样细胞(myofibroblasts,MFB)。活化的HSCs产生纤维细胞因子和生长因子等,这些因子通过旁分泌和自分泌持续作用于受损肝脏,导致汇管区和肝小叶内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度积累,直接诱导肝纤维化的形成;另外,活化的HSCs更易迁移并黏附至肝窦内皮,进一步稳定基底膜,阻碍肝细胞物质交换,进一步加剧肝纤维化。因此,药物靶向抑制HSC活化,干预其生物学行为如:迁移与粘附等,是治疗肝纤维化的有效策略。高效无毒的天然活性成分用于治疗肝纤维化己成为当今肝病领域的研究热点。我们基于前期大量的文献调研发现姜科植物属莪术是传统中医药治疗肝硬化等肝脏疾病不可或缺的一部分。莪术发挥功效主要归因于莪术挥发油,莪术油制剂已被我国药典收录为抗癌药物及抗病毒药。莪术醇(Curcumol)是莪术挥发油发挥抗癌、抗病毒、抗菌等作用的主要有效成分之一。另有文献报道莪术醇可以体外抑制HSC活化,但是其抗肝纤维化的作用尚需确证,其深入的作用机制有待进一步揭示。大量研究显示通过细胞死亡清除活化的HSCs是治疗肝纤维化的重要举措。最新研究表明程序性坏死参与调控肝癌,脂肪肝病的疾病进程,并且有研究初步表明药物诱导的程序性坏死能够抑制HSC活化。因此,本论文提出莪术醇通过促进HSC程序性坏死改善四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化。同时,莪术醇诱导的程序性坏死信号竞争性抑制促细胞生长的核因子κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)信号途径,进一步抑制骨膜蛋白(periostin,POSTN)介导的活化型HSC的迁移、黏附,进而发挥抗肝纤维化作用。本研究旨在明确莪术醇的抗肝纤维化作用并揭示其作用的分子机理。本研究的结果为开发莪术醇作为抗肝纤维化药物提供实验依据。[研究方法]1.细胞水平选取永生化人肝星状细胞LX2细胞株作为本论文体外研究对象。Cell Counting Kit-8体外筛选莪术醇作用于HSC-LX2细胞的给药浓度;Real-time PCR、Western blot、免疫荧光染色法检测HSC-LX2细胞内目的基因及蛋白的表达情况;台盼蓝染色检测HSC-LX2的细胞死亡情况;电子透射显微镜观察HSC-LX2细胞内程序性坏死特征;试剂盒检测HSC-LX2细胞上清中的LDH、ATP、MDA、SOD、GSH以及POSTN水平;蛋白质免疫共沉淀检测HSC-LX2细胞中受体相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1,RIPK1)与RIPK3的结合情况;JC-1染色检测HSC-LX2细胞中的线粒体膜电位;荧光探针DCFH-DA进行HSC-LX2细胞内活性氧的检测;Mito Sox红色荧光探针检测HSC-LX2细胞线粒体内过氧化物;细胞划痕及Transwell小室检测细胞迁移情况。2.动物水平建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型,给予小鼠低、中、高剂量(15、30、60 mg/kg)的莪术醇治疗;构建RIPK3基因敲减小鼠及POSTN基因敲入小鼠,进一步建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型并给予莪术醇(30 mg/kg)治疗。苏木精伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色检测小鼠肝脏病理结构;马松和天狼星红染色检测小鼠肝脏内胶原沉积;试剂盒检测小鼠血清中肝损伤相关指标,酶联免疫吸附试剂盒检测小鼠血清中炎症相关因子及肝纤维化四项指标;免疫组织化学染色观察小鼠肝脏中炎性浸润、HSC活化指标α肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、POSTN的表达情况;Western blot检测小鼠肝脏内纤维化相关因子的表达情况;免疫荧光双染检测α-SMA与纤维化相关因子、程序性坏死关键因子、NF-κB、POSTN的共定位情况;分离各组小鼠原代HSC,Western blot检测纤维化相关因子、程序性坏死关键因子的蛋白丰度。[研究结果]1.血清学检测和形态学分析结果显示莪术醇能够显著降低CCl4诱导的小鼠肝脏损伤、炎症反应并且能够显著减轻CCl4刺激的肝细胞脂肪变性,胶原沉积,以及肝脏病理性血管生成进而改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化。2.体外研究发现,莪术醇抑制HSC活化相关指标的基因与蛋白表达。机制研究发现,莪术醇抑制HSC活化依赖于HSC程序性坏死而非凋亡的发生。进一步实验显示,莪术醇不仅增加HSC-LX2细胞中RIPK1、RIPK3的表达,并且促进两者的相互结合,表明RIPK1/RIPK3复合体是莪术醇诱导HSC程序性坏死所必需的。体内研究结果显示,RIPK3敲减小鼠肝纤维化程度明显增强,给予莪术醇治疗的小鼠肝脏中RIPK3水平几乎恢复至正常水平并且胶原沉积情况得到一定的改善。3.深入机制探究发现,莪术醇诱导HSC的RIPK1/RIPK3依赖性程序性坏死是通过促进线粒体超氧化物的产生及线粒体膜电位的丢失,影响HSC内线粒体功能紊乱,进而促进HSC细胞死亡。另外,RIPK3促进线粒体ROS生成、去极化依赖于c-Jun氨基端激酶1/2(c-Jun NH2-terminal Kinase1/2,JNK1/2)的激活。4.莪术醇诱导的程序性坏死信号可以竞争性抑制促细胞生长的NF-κB信号,削弱POSTN的分泌与表达,抑制HSC的迁移与粘附,进一步发挥抗肝纤维化的作用。[研究结论]本研究首次证明莪术醇能够显著地减轻CC14诱导的小鼠肝脏损伤、炎症反应,改善其肝纤维化;莪术醇通过促进RIPK1/RIPK3复合体的形成,激活JNK1/2,诱导线粒体超氧化物的产生及线粒体膜电位的丢失,影响HSC内线粒体功能紊乱,进而促进HSC细胞程序性坏死,抑制HSC活化;莪术醇诱导的程序性坏死信号可以竞争性抑制促细胞生长的NF-κB信号,削弱POSTN的分泌与表达,抑制HSC的迁移与粘附,进而改善肝纤维化。本论文确证了RIPK3依赖性的程序性坏死在莪术醇改善肝纤维化中的作用,深入揭示了其分子机理,为莪术醇开发为临床有效的抗肝纤维化药物提供了有力的实验依据。