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桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）是我国重要的毁灭性果蔬害虫,取食为害多种水果和蔬菜,繁殖力强,防治困难。桔小实蝇成虫羽化后需取食才能完成生殖成熟,进而交配产卵。因此研究桔小实蝇雌虫生殖发育分子机理,不仅可以为丰富和完善昆虫生殖调控机制提供新线索,而且为桔小实蝇高效、简便和可持续绿色防控提供理论基础。本研究从我们实验室前期建立的桔小实蝇雌虫转录组文库中鉴定得到了6个在初羽化与性成熟时期差异表达的COP9信号复合体亚单位基因csn2、csn3、csn4、csn5、csn6、csn7;利用实时荧光定量PCR技术研究其时空表达模式;选择在桔小实蝇性成熟时期及卵巢组织高表达的csn3、csn5,通过RNAi、Hiseq测序等分子生物学技术,研究其在桔小实蝇雌虫卵巢发育、繁殖力等生殖发育过程中的功能及分子调控机理。1、桔小实蝇COP9复合体亚单位基因鉴定及时空表达模式研究我们从桔小实蝇雌虫转录组文库中选取在桔小实蝇初羽化与性成熟时期差异表达COP9复合体亚单位基因csn2、csn3、csn4、csn5、csn6、csn7,通过NCBI比对及DNAman多序列同源比对,发现6个亚单位基因与辣椒实蝇Bactrocera latifrons、橄榄实蝇Bactrocera oleae、瓜实蝇Bactrocera cucurbitae、地中海实蝇Ceratitis capitata等实蝇科昆虫的同源相似性在84%,和果蝇Drosophila melanogaster同源相似性在67%。随后将6个亚单位基因编码的氨基酸序列与果蝇、地中海实蝇、埃及伊蚊Aedes aegypti、小菜蛾Plutella xylostella、意大利蜜蜂Apis mellifera、斜纹夜蛾Spodoptera litura、棉铃虫Helicoverpa armigera、赤拟谷盗Tribolium castaneum、豌豆长管蚜Acyrthosiphon pisum、褐飞虱Nilaparvate lugens的同源序列构建系统发育树,不同物种间的csn2-csn7各亚单位基因均各自聚在一大分支,表明COP9亚单位基因在不同物种间的遗传距离较近。我们通过实时荧光定量PCR检测了6个亚单位基因在桔小实蝇中的时空表达模式。不同发育阶段表达模式结果显示,csn2-csn7个亚单位基因均在卵期高表达;csn3、csn5亚基除在卵期高表达外,在性成熟时期也高表达;csn2、csn6、csn7除在卵期高表达外还分别在预蛹、初羽化时期、性成熟时期有较高表达。不同生殖发育时期雌、雄虫的表达模式结果显示,csn3、csn4、csn5在性成熟及交配后的雌虫中高表达,在雄虫各阶段之间无明显差异;csn2、csn6、csn7表达量在初羽化、性成熟、交配后三个时期无差异,雌雄虫之间也无明显差异。不同组织的表达模式结果显示,各亚单位基因在不同组织都有表达,其中,csn3、csn5在卵巢中表达量明显高于其它组织,csn7在精巢中表达量显著高于其它组织。成虫卵巢及脂肪体不同生殖发育阶段的表达模式结果显示,6个COP9亚单位基因随着桔小实蝇卵巢的发育成熟其表达量呈现上升趋势,均在羽化后11-15d（性成熟时期）卵巢中高表达。6个COP9亚单位基因在成虫不同天数脂肪体中的均有表达,csn2、csn3、csn5在11d时表达量较高,csn2、csn4、csn6在初羽化1d时表达量较高。根据以上表达模式结果,我们选取在桔小实蝇性成熟雌虫卵巢组织高表达的csn3、csn5两个基因,进行下一步功能研究。2、csn3亚单位基因功能研究为研究csn3在桔小实蝇雌虫生殖发育过程中的功能,我们在体外合成csn3ds RNA,利用显微注射dscsn3进行RNA干扰。结果表明,沉默csn3基因后,桔小实蝇产卵量与对照组相比明显下调,但卵巢形态发育、交配率及孵化率无显著变化。我们进一步通过q RT-PCR检测了桔小实蝇卵黄原蛋白基因（Vitellogenin,Vg）vg1、vg2、卵黄原蛋白受体基因yolkless的表达量,发现沉默csn3基因后,vg1、vg2和yolkless表达量均显著下调。以上结果说明,csn3基因通过调控桔小实蝇雌虫的卵黄沉积及其产卵进而影响其生殖。3、csn5亚单位基因的功能研究为了研究csn5在桔小实蝇雌虫生殖发育中的的功能,我们利用RNAi技术沉默桔小实蝇雌成虫csn5。结果表明,沉默csn5基因后,桔小实蝇卵巢发育明显迟缓,并且产卵量显著下调,但交配率及孵化率无明显变化。为了明确csn5调控桔小实蝇雌虫生殖发育的分子机理,我们利用RNAi技术沉默桔小实蝇雌成虫csn5,然后提取干扰组与对照组的卵巢组织总RNA进行高通量测序,筛选差异基因或差异信号通路。通过分析转录组数据,共筛选得到398个差异基因,涉及多个信号通路及生命活动。根据GO、COG等功能注释,我们在这些差异表达基因中发现了参与蜕皮激素合成途径的细胞色素P450家族基因、蜕皮激素激酶、卵黄原蛋白基因、以及脂肪酶等。其中,细胞色素P450 CYP301a1及CYP313a4在干扰组表达量明显下调,蜕皮激素激酶1 Ec K1、蜕皮激素激酶2 Ec K2及蜕皮激素激酶3 Ec K3表达量显著上调。我们通过q RT-PCR验证了这些基因在干扰组与对照组的表达量,结果与转录组数据一致。进一步检测了蜕皮激素信号通路关键上游转录因子Ec R、USP、E75以及vg1、vg2表达量,结果表明,干扰csn5后,以上基因均出现显著下调。综上,csn5在桔小实蝇雌虫生殖过程中发挥重要作用,干扰csn5影响了蜕皮激素合成与信号转导,进而影响了卵黄原蛋白合成与卵黄沉积,最终导致卵巢发育迟缓和产卵量下降。