内生放线菌KLBMP2170抗杨树褐斑病活性及机理研究

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本文通过对红豆杉的内生放线菌进行分离,从其根、茎、叶中共分离出212株放线菌,通过对其进行培养特征、形态特征的观察、16S rRNA基因测序以及序列分析,表明链霉菌属为优势类群,其中111株为链霉菌,它们被分为8个分类群,分别为白孢类群(Albosporus)、黄色类群(Flavus)、玫瑰孢类群(Roseosporus)、格劳科斯(Glaucus)、烬灰类群(Cinereus)、灰红紫类群(Griseorubroviolaceus)、灰褐类群(Griseofuscus)、金色类群(Aureus)。对分离得到的111株链霉菌进行抑制杨树褐斑病病原真菌活性筛选,结果显示:KLBMP 2009,KLBMP 2051,KLBMP 2061,KLBMP 2078,KLBMP 2088,KLBMP2170,KLBMP 2174,KLBMP 2176等都对杨树褐斑病病原真菌具有抑制活性,但KLBMP 2170的活性最强。然后就针对KLBMP 2170进行研究,首先通过对红豆杉内生放线菌KLBMP 2170进行同源性测定,测定结果为:KLBMP 2170保守序列为1488 bp,并运用EzTaxon数据库进行相似性比对,比对结果表明:KLBMP 2170为链霉菌属成员,与Streptomyces armeniacus相似性达到97.84%,与Streptomyces artemisiae相似性达到97.38%,除此之外,KLBMP 2170在系统发育树上独立成一分支,因此KLBMP 2170可能为潜在的链霉菌属新种。以杨树褐斑病病原真菌Marssonina brunnea CFCC 89647为供试病原菌,以KLBMP 2170发酵液对CFCC 89647的抑菌率为指标,进行KLBMP 2170培养基优化和发酵条件优化,优化结果为:淀粉含量为10 g/L,酵母浸膏含量为10 g/L,葡萄糖含量为11 g/L,(NH4)2SO4含量为4.0 g/L,pH=7.0,培养时间为7 d,温度为28℃,转数为160 r/min。对KLBMP 2170菌株发酵液的稳定性及作用机理研究,研究结果证明KLBMP2170发酵液对光照、紫外线的稳定性较好,但在PH<5,温度大于120时℃时稳定性有所下降。另外KLBMP 2170发酵液中的活性代谢产物能裂解杨树褐斑病病原真菌的细胞壁,导致菌体空间结构塌陷,并且对细胞膜系统的完整性造成影响,导致菌体胞内内含物外漏,使得胞内蛋白含量减少,导致细胞死亡。根据杨树叶片石蜡切片的对比照片,健康杨树感染褐斑病病原菌后,菌丝侵入杨树叶片的栅栏组织和海绵组织,主要是侵入叶片栅栏组织,使其细胞排列由紧密有序变得疏松杂乱,并出现明显胞间隙。另外通过杨树叶片离体、活体实验,结果表明无论在离体还是活体条件下KLBMP 2170发酵液对杨树病原菌均有抑制作用。对KLBMP 2170发酵液乙酸乙酯相活性组分进行GC-MS分析,共鉴定19个化合物,其中苯乙酸(phenylacetic acid)、丁香酚(eugenol)、丁位十二内酯(Dodecalactone)为已报道的具有抑制真菌活性的化合物,并对其进行化合物分离,结合核磁及质谱共鉴定三个化合物,分别为穗花杉双黄酮、球毛壳菌素F、sclerotioramine。此外对正丁醇相的活性组分进行LC-MS分析,其中RS-22A、Scopafungin、Spirofungin为已报道的具有抑制真菌活性的化合物。
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