研究背景骨髓炎是骨的细菌感染,其特征在于伴随反应性骨形成的进行性炎性骨破坏（骨质溶解）,并且可涉及任何骨的一小部分或几个区域。导致骨髓炎的初始感染可以从病原体的血源性接种到身体的另一个部位,或通过创伤或手术伤口直接接种。这导致急性感染,通常持续数天或数周,并且可能需要抗生素和/或外科手术干预。当致病微生物持续超过10天并导致骨进一步破坏时,感染被认为是慢性骨髓炎。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是儿童和成人急性和慢性骨髓炎的单一主要原因,约占这些感染的80%。其他微生物如凝固酶阴性葡萄球菌,链球菌属,肠球菌属和结核分枝杆菌也可能引起骨髓炎,但金黄色葡萄球菌是迄今为止最常见的细菌,由于毒力因子有助于它逃避许多宿主防御。由于临床假体和骨折固定装置的使用数量增多,骨感染数量在过去几十年中有所增加。虽然手术技术的改进和积极的抗生素预防使骨科植入术后的感染率降低到不到5%,但骨髓炎仍然是一个严重的问题。大约50%的临床分离株是耐药的金黄色葡萄球菌菌株,如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）,这些菌株通常在医院和社区环境中获得。此外,MRSA己经超过艾滋病病毒,成为北美最致命的病原体,并继续使慢性骨髓炎的治疗更加困难。二期翻修手术的假体周围MRSA感染的目前的估计表明,再感染率约为15%-25%。然而,这些数字实际上可能更高,因为它们没有考虑到由于持续感染而不能进行翻修手术的患者比例,这些患者不允许再植入装置。这表明存在对替代性介入策略的主要需求,特别是对于免疫受损的个体（即患有糖尿病或HIV感染的患者）,服用免疫抑制药物的患者,以及共同构成大多数接受全关节置换的患者的老年人。美国每年大约发生112,000例与骨科器械相关的感染,每次事件的成本约为15,000-70,000美元。虽然在过去十年,关节假体和骨折固定装置的感染率分别仅为0.3-11%和5-15%,但这些感染可能导致截肢甚至死亡。此外,尽管未经证实,选择性TJR的“微创手术”的普及,其中非常小的切口可能导致植入期间假体接触皮肤的并发症,与骨髓炎的发病率显着增加有关。这些感染需要非常昂贵的二期翻修手术,最近的报告表明,成功率可能低至63%。目前,可用于预防接受人工全关节置换手术（total joint replacement,TJR）手术的患者的MRSA感染的预防性治疗是术前抗生素,例如万古霉素。然而,过度使用这些“最后的”抗生素导致出现对甚至我们最有效的抗生素具有抗性的菌株。因此,免疫低下和老年患者必须获得替代性介入策略,这些患者共同占美国每年150万TJR的大部分。因此,将MRSA发病率降低50-80%的疫苗可以减少关节置换和开放性骨折修复手术的头号并发症,并且还可以减少相似数量的医疗负担。过去150多年研究,已初步明确了微生物发病机制,也适用于解释骨髓炎的发生机制。感染的最初步骤发生在单个细菌侵入身体时,微生物必须响应环境变化并表达毒力基因,这将有助于它抵抗先天免疫并为其提供附着于宿主的粘附素受体。微生物还依赖于来自坏死组织或诸如植入物的异物的宿主结构的存在。成功完成这些步骤导致指数生长阶段,其在营养物耗尽和/或适应性免疫的发展时停止。在指数增长阶段之后,在被称为生物膜的复杂细胞外基质内,细菌被迫在休眠生长条件下持续存在。此时感染是慢性的,并且不能通过药物或宿主免疫来根除。由于初始附着的重要性,该领域的焦点一直是细胞表面粘附素,它与细胞外基质成分特异性相互作用,称为MSCRAMMs（识别粘附基质分子的微生物表面成分）。事实上,迄今为止开发的大多数抗金黄色葡萄球菌靶向治疗都针对的是对宿主组织定植和侵袭很重要的MSCRAMM。这些疫苗的目的是产生通过与粘附素结合而阻断与宿主组织附着的抗体。不幸的是,金黄色葡萄球菌具有许多粘附素,因此抑制一种粘附素可能不足以防止细菌附着。本实验旨在寻找MRSA新的变异性小的抗原靶向结合位点,并明确其结合机制,并用人工合成短肽来对万古霉素等抗生素进行修饰,以期得到在治疗骨髓炎时减少抗生素用量,缩短疗程,提高疗效等结果。研究目的1.鉴定骨髓炎在体内用于靶向治疗的抗原。2.获得该抗原抗体的特殊结合位点。3.后续治疗措施。方法1.骨折术后骨髓炎小鼠模型的建立我们采用6-9周龄的雌性SPF级C57BL/6野生型小鼠作为实验对象,用氯胺酮（100mg/kg）和甲苯噻嗪（10mg/kg）麻醉后,在胫骨中段截骨制造骨折模型后,用针垂直于胫骨平台从胫骨平台穿入后引发感染（针预先用带绿色荧光的金黄色葡萄球菌浸泡取出后干燥20分钟形成生物膜）。仔细缝合皮肤,避免额外的环境暴露。一旦小鼠从麻醉中恢复,他们将被送回标准隔离笼而在下一步实验开始前无需额外治疗。2.金黄色葡萄球菌总蛋白的提取及特异性噬菌体及短肽的筛选及扩增下一步是测定这些潜在保护性抗原的分子身份。通过二维聚丙烯酰胺凝胶分离金黄色葡萄球菌总蛋白,使用骨髓炎患者血清与金黄色葡萄球菌总蛋白反应后,通过与噬菌体库相结合,筛选并得到特异性结合力较强的噬菌体,通过噬菌体序列可得到特异性较强的短肽序列,从而合成特异性较高的短肽。3.体内实验步骤一中的小鼠分为四组,分别注射安慰剂作为对照;A组注射筛选出的短肽;B组注射对照组短肽;C组注射筛选后的短肽（该组独立建模,手术方法不变,细菌为相同荧光且GMD基因消除后的MRSA）,剂量均为0.1mg/kg/d,并在注射后第0.3.7.14天在活体成像仪中BLI荧光显色,观察其结果。结果1,成功制造了骨折内固定术后感染的小鼠模型。2,从双向蛋白电泳凝胶结果看出,有一半的区域内均有显色,其中以138-kDa金黄色葡萄球菌自溶素（GMD）最为明显。我们对结合力较高的噬菌体进行了测序,筛选出特异性结合序列15种,其中TRAP2及AMD1序列特异性结合数最高以其为特异性抗原结合位点。3,小鼠体内实验结果表明:筛选出来的短肽能够特异性识别骨髓炎模型中的金黄色葡萄球菌,但如果金黄色葡萄球菌本身缺少GMD抗原时,筛选出的短肽并不识别。显示了其靶向结合病灶处MRSA的能力。结论1.C57BL/6小鼠骨髓炎模型约在14天就可形成;2.金黄色葡萄球菌确实存在稳定结合的高度保守保护性抗原（GMD）;3.通过针对其保护性抗原结合位点合成的多肽确实可以体内靶向结合金黄色葡萄球菌。