研究背景过去的研究发现,过量或者高强度的运动可能会导致关节软骨局部微代谢紊乱,关节局部组织营养不良或坏死,最终使关节软骨出现退行性变,并诱发骨性关节炎(osteoarthritis, OA)。可是,其他研究[4-6]发现作用于关节上的力对关节的结构来说并非绝对有害的,相反,适度的压力对维持骨关节代谢的稳态至关重要,而完全的零受力却可对关节软骨(articular cartilage)产生消极影响。比如,过去我们的研究发现过量的跑台运动可能会导致关节软骨的退行性变,而中等强度的跑台运动却能维持关节软骨代谢的内稳态。同样,因关节制动(immobilization)导致的关节负重减少,可能会对关节软骨产生分解作用,并且这种影响的大小是由制动时长决定的。事实上,过去很多研究证实关节制动能够对关节软骨的形态、生理生化功能,以及生物机械性能产生影响[9-13]作为人体最常见的关节疾病,关节软骨的退化是OA最典型的特征之一,也是关节结构和运动功能损伤的病理基础[16]。膝关节作为人体活动量最大的负重关节,是人体退行性病变发生最常见的部位。这种风险在老年人中尤为突出,因为膝关节骨性关节炎(osteoarthritis of knee, KOA)导致关节活动能力丧失的危险性,大于其他所有医疗疾患的总和[17]。然而,当前越来越多的观点认为除了关节软骨,软骨下骨(subchondral bone)病理生理的改变也是OA产生的重要因素之一。但是,对于软骨下骨和关节软骨在OA发病机制中各自所起到的作用及其相互关系,仍然存在很多问题尚不明确。比如,对于软骨下骨的病变究竟是早于还是晚于关节软骨依旧存在很大争议。虽然以往很多实验探讨了两者病变发生的先后关系,但是得到的结论并不一致：它们发现关节软骨的变化可能早于、晚于或者同时伴发于关节软骨的病变[20-22]。导致这些不一致结果的原因可能是多方面的,比如各个研究所采用的OA模型的差异,OA处于不同的疾病进展期,或是它们所采用实验动物模型的差异。过去的研究发现,关节软骨和软骨下骨之间在代谢层面上存在着极其复杂的联系(coupling),关节软骨的完整性可能会受到软骨下骨重塑(bone remodeling)的影响。此外,许多证据表明关节制动可能会引发关节软骨的萎缩[11],但是目前人们对于制动对软骨下骨的作用,以及软骨下骨在关节软骨退化过程中所扮演的角色及相关机制了解甚少。通过查阅文献我们发现,到目前为止只有两项动物实验旨在研究在关节制动条件下,软骨和软骨下骨的变化及相互联系。其中,在一项兔子制动模型的实验中,研究人员发现股骨干骺端骨密度显著降低,而股骨软骨总粘多糖(glycosaminoglycan)和羟脯氨酸(hydroxyproline)的水平却直到制动3周后仍然保持不变。相反,另一项动物实验发现,将犬膝关节行支具制动4周后,关节软骨在出现较温和变化的同时软骨下骨厚度却没有受到明显的影响[24]。上述两个实验所得到的研究结论并不一致,并且它们的实验设计本身存在缺陷,即均以单个时间点对软骨和软骨下骨进行评价,且均未能深刻阐明软骨下骨在制动中对软骨产生的影响及机制。本研究克服了上述实验的缺陷,将鼠膝关节分别制动1周,4周和8周,利用Micro-CT来研究软骨和软骨下骨在结构上不同时间点的变化情况。我们通过对软骨和软骨下骨切片组织染色,在形态学上对两者在制动条件下产生的变化以及它们之间的联系进行了研究。研究目的1、探讨不同时长的制动对实验鼠膝关节软骨下骨的影响；2、探讨不同时长的制动对实验鼠膝关节软骨的影响；3、探讨上述两者变化之间的相互关系。研究方法1、实验动物和制动方案36只成年雄性、体重介于210g至250g的Wistar大鼠被随机均分到以下三组：(1)1周处理组(1W,n=12)；(2)4周处理组(4W,n=12)；及(3)8周处理组(8W,n=12)。各组随机挑选6只大鼠,并随机选择单侧膝关节作为制动膝关节区域(immobilized knee region,IKR),通过内固定的方法分别固定1、4或8周,同时对侧膝关节则不作处理,作为非制动膝关节区域(non-immobilized knee region, non-IKR),各组中剩余的6只大鼠不做无任何处理,随机取单侧膝关节作为外部对照膝关节区域(external control knee region, ECKR).各组实验鼠麻醉后,将5cm长的克氏针垂直插入小鼠制动侧股骨近端和胫骨远端,克氏针两端打结形成一个完整的闭环,并使膝关节呈150。屈曲位。手术过程中注意膝关节腔和关节软骨不被破坏。手术后立即行X线照射确保制动效果。2.标本处理实验开始和结束时为每只实验鼠称重,并且在经过相应时长的处理(制动或者非制动)后,使用0.3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后处死。对于每组中的制动鼠,截取出所有制动膝关节区域和非制动膝关节区域的股骨并去除软组织,随后使用硬组织切片机(EXAKT 3000 CP Band System, Norderstedt,Germany)将股骨髁部分切下。对于每组中非制动鼠,随机选择一侧膝关节(即外部对照膝关节区域)接受同样上述处理。每根股骨近端行Micro-CT(Sky Scan 1076 Micro-CT system, Kontich, Belgium)检测；随后将这些标本浸泡在pH=7.4的4%稀释福尔马林溶液中24小时,之后将每份样本包埋入石蜡中,并通过10%的EDTA脱钙。最后,股骨样本在冠状面从内到外被切成5 μm厚的薄片。3.检测指标3.1 Micro-CT检测：所有股骨远端均通过Micro-CT (SkyScan 1076 Micro-CT system, Kontich, Belgium)检测。X线管的电压为88KV,电流为100 μA,并且配备铝质过滤器。扫描从股骨远端生长板开始,向近端推进3.2mm区域为感兴趣区域(region of interest, ROI)。松质骨通过分离骨皮质获得。测量的参数包括：骨体积分数(BV/TV,%),骨小梁厚度(Tb.Th, mm),骨小梁间隔(Tb.Sp, mm),结构模型指数(SMI),各向异性的程度(DA), Tb.Pf (1/mm)以及骨小梁数量(Tb.N)。软骨下骨板的测量参数包括骨体积分数(BV/TV,%),骨小梁厚度(Tb.Th, mm)和孔隙率(porosity,%).3.2组织形态学检测：每个切片都经过HE、SO以及天狼新红染色。观察的指标包括：关节软骨和软骨下骨结构,软骨细胞状态,毛细血管增生情况,以及潮线等。其中,关节软骨的平均厚度定义为在切面中点两旁约300 μm范围内,从软骨和软骨下骨过度区域到关节软骨表面的平均距离。关节软骨细胞数被定义为在400 μm长,100 μm宽长方形内的软骨细胞的数量。计数时,软骨细胞在HE染色下呈现蓝色,并且每个不同区域都由两名不同的研究者独立计数并取平均值。带有成像分析功能的尼康-H600显微镜被用来观察SO染色的情况,观察对象为被天狼新红染色的胶原蛋白的排列情况。用于观测的显微镜配备有和极性光谱配对的影像分析系统(Olympus CCD DP71/Olympus Microscope BX-51)。结果1.Micro-CT结果1.1软骨下松质骨的Micro-CT结果：软骨下松质骨的Micro-CT结果可参见表2,从中可以发现制动膝关节区域和非制动膝关节区域的比较中,许多指标的变化是有意义的(p<0.05),而非制动膝关节区域和外部对照膝关节区域的比较则较少发现显著性差异(p>0.05)。总的来说,关节制动会导致更低的BV/TV和Tb.Th,以及更高的Tb.Pf,并使松质骨向柱状转变。更重要的是,这些变化随着时间的推进而更加明显。1.2软骨下骨板的Micro-CT结果：a.软骨下骨板的厚度在4周末,制动膝关节区域较非制动膝关节区域(0.109±0.011mm vs.0.138±0.018 mm, p=0.013)更薄。8周末,在内侧(0.107±0.017 mm vs.0.134±0.015 mm, p=0.014)和外侧(0.101±0.014mm vs. 0.139±0.011mm, p=0.000),软骨下骨板的厚度都薄于非制动膝关节区域。b.在1周末,外侧的制动膝关节区域软骨下骨板的孔隙率相比于非制动膝关节区域更高(64.6±7.2% vs.39.9±5.9%,p=0.027)。同样在4周末,制动膝关节的孔隙率和非制动膝关节区域相比,无论在内侧(72.5±8.2% vs.42.6±7.9%,p=0.022)还是在外侧(72.1±8.0% vs.42.4±6.6%,p=0.041)都更高。在8周末,和外侧非制动区域相比,内侧制动膝关节区域的孔隙率显著增高(72.1±8.1%vs.42.4±6.6%,p=0.024)。2.形态学改变2.1HE、 SO和天狼新红染色图片结果通过HE和SO染色,我们发现关节软骨和软骨下骨的形态和组织微结构均发生了显著退化。HE染色下,非制动区域软骨表面和制动区域相比更为平滑,软骨细胞较为均匀地分布在软骨各区域中。SO染色中,可以清晰地观察到潮线,骨和软骨交界区域联系紧密,而血管侵袭至软骨下骨板并达关节软骨的情况则较为少见。相反,制动膝关节区域在SO染色下,软骨表面的细胞排列变得不规则,同时细胞数量减少,并且这种变化随着制动的持续而加剧。相反,我们发现软骨细胞在第1周末出现肥大,随后第4、8周末出现萎缩。在制动膝关节区域,和软骨层上方区域相比,中间和下方区域的软骨细胞逐渐减少,这种现象在血管侵袭部位周围尤为明显。此外,在钙化软骨和软骨下骨组织中可见侵袭血管,而其周围软骨细胞则出现肿胀变化。另外,和非制动区域相比,制动膝关节区域中软骨细胞层下的沉积线(cement line)呈不连续改变,而软骨下骨厚度则随制动时间增厚。通过天狼星红染色,我们发现随着制动时间延长,制动膝关节区域的胶原蛋白纤维厚度逐渐降低,且在制动膝关节区域的切片中可见胶原蛋白纤维在第4周末出现排列紊乱,并且随着制动时间的延长胶原纤维逐渐减少并消失。2.2软骨细胞数量和关节软骨厚度：软骨细胞数量(个)在第1、4、8周时,在外部对照膝关节区域分别为91.83±5.34、93.67±6.53、92.5±5.36,在非制动膝关节区域组分别为89.83±5.34、88.17±5.49、86.83±3.67,而在制动膝关节区域组分别为83.33±4.55、72.17±3.82、65.33±3.33。其中,制动膝关节区域组中的软骨细胞数量相较于外部对照膝关节区域在第8周是显著减少的,相较于非制动膝关节区域组在第4周和第8周也是显著减少的。关节软骨层的厚度(u m)在第1、4、8周时,在外部对照膝关节区域分别204.56±9.92、212.03±10.68、209.61±9.19,在非制动膝关节区域组分别为207.46±10.03、206.97±8.83、203.91±7.79,在制动膝关节区域组分别为205.28±10.48、186.43±4.43、177.53±3.09。其中,制动膝关节区域的关节软骨层厚度在第4周和第8周时相对于非制动膝关节区域和外部对照膝关节区域均是显著减小的。结论第一部分结论不同时长的制动会使软骨下骨微结构变得更薄、更疏松以及更脆,骨小梁向柱状改变,并且上述退变是随着制动时间的延长而加重的。上述结果表明制动对软骨下骨是有消极影响的,并且可能会诱发OA和OP的发生,这为今后对这两种疾病的预防和治疗提供了新的思路。第二部分结论制动对于关节具有消极影响,并且随着制动时间的延长,关节软骨和软骨下骨的退变程度均会加重。同时,制动诱导的软骨下骨的退变早于关节软骨的退变,并且是关节软骨退变的直接原因之一。因此,对于临床上需要较长时间制动处理的病人,均需慎重对待,并在条件允许的情况下尽快恢复功能锻炼。另一方便,制动可能是OA的诱导因素之一,但是目前的研究还不够完善,需要进一步的实验研究制动在OA发病机制中的作用,这可能为今后相关疾病的治疗提供新的思路。