细胞穿透肽在中国卤虫中的穿透效果研究

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细胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs),是近年来发现的一类长度小于30个氨基酸,自身具有细胞内化作用,并且能介导与之相连接的外源性生物分子进入细胞之中的小分子肽段。中国卤虫(Artemia sinica)则是一种很好的甲壳类实验模式动物,其休眠卵易于保存和孵化,适合在实验室中操作。本研究以中国卤虫(Artemia sinica)作为研究对象,使用随机12肽噬菌体展示文库对中国卤虫进行了细胞穿透肽(CPP)的淘选,构建了细胞穿透肽与增强型绿色荧光蛋白(CPP-EGFP)融合蛋白的原核表达载体;通过诱导CPP-EGFP并对其进行纯化后,在中国卤虫中进行了细胞穿透活性的研究。本研究主要得到了以下结论:1.中国卤虫特异性细胞穿透肽的淘选使用随机12肽噬菌体展示文库,对中国卤虫进行四轮淘选,严格检测每轮淘选过程中噬菌体的回收率,当噬菌体的回收率达到10-5时,表明噬菌体在淘选中的富集取得了一定的效果;之后,再检测淘选所得到的单克隆噬菌体的回收率,当噬菌体回收率高于最后一轮淘选的回收率时,表明淘选取得了成功。本研究在淘选完成之后,成功得到了中国卤虫的细胞穿透肽的序列。2. CPP-EGFP的原核表达、纯化及CPP穿膜活性的验证将淘选得到的小肽与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的编码序列导入原核表达载体pGEX-2T,优化诱导表达条件,最后确定了在16℃,0.1mM IPTG,16h表达条件下可以得到较多的可溶性蛋白,用GST纯化柱纯化收集GST-EGFP-CPP融合蛋白。利用纯化所得到的GST-EGFP-CPP融合蛋白对中国卤虫进行处理,在荧光显微镜下进行观察,发现有一条CPP在3h开始在中国卤虫消化道内开始富集,在6h的时候富集效率最高。富集的方式是逐渐扩散至整个消化道。证明随着时间增长,穿透效率增加。3.细胞穿透肽在甲壳动物上研究筛选方法的建立本研究的两个部分,是在甲壳动物上发现和验证特异性的细胞穿透肽的一套完整的方法,为今后其它在甲壳动物上发现和应用特异性的细胞穿透肽奠定基础。
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