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研究目的:肠上皮是机体内外环境的重要屏障,常受到化学、微生物和免疫原破坏,肠干细胞(intestinal stem cell ISC)自我更新、增殖和分化(干性)是肠上皮再生的基础。肠干细胞稳态与肠道疾病紧密相关,干细胞功能缺失引起肠上皮修复障碍,过度激活则可能诱发结直肠肿瘤。肠干细胞稳态维持是基础和临床研究的热点、难点问题。文献报道雌性小鼠结肠上皮细胞增殖随生理动情周期发生波动,提示雌激素可能参与了肠干细胞增殖调节,但机制不清。肠道疾病如炎症性肠病、结直肠肿瘤等发生发展存在性别差异,有必要针对性研究雌激素及其受体在不同性别群体肠道的生理/病理作用。G蛋白偶联雌激素受体(G protein coupled estrogen receptor,GPER)也称为GPR30,是特异性的雌激素膜受体,GEPR被特异性激活后通过G蛋白介导的信号途径引起下游多条信号通路的激活,在多种组织和细胞中GPER可参与细胞增殖的调节。我们前期研究发现在肠隐窝干细胞表达GPER,GPER激活对损伤后隐窝细胞增殖能力发挥保护作用,提示GPER在肠干细胞增殖中发挥作用。GPER是否参与了生理肠干细胞稳态维持迄今未见报道。本课题中,我们利用卵巢去势小鼠针对性研究GPER在雌性小鼠肠干细胞稳态维持中的作用。研究方法:1.实验动物分组及处理:健康雌性成年C57BL/6小鼠,异氟烷持续吸入麻醉,无菌条件下行双侧卵巢去势术,术后两周后开始实验。分组:动物随机分为三组,对照组每天8am腹腔注射生理盐水0.1ml,G-1处理组每天8am腹腔注射选择性GPER激动剂G-1(0.03mg/kg)溶液0.1ml,MEK抑制剂组(PD组)每天8am腹腔注射PD0325901(1mg/kg)溶液0.1ml,G-1注射14天或28天后牺牲动物,PD治疗组10天后牺牲动物。取回肠、结肠,常规制备组织石蜡切片,进行HE染色、免疫组织化学和免疫荧光染色检测,或快速放入液氮冻存以备QRT-PCR或 Western blot 检测。2.肠炎模型:卵巢去势小鼠每天8am分别给予0.1ml生理盐水或G-1溶液腹腔注射28天,第29天腹腔注射大肠杆菌来源的脂多糖(LPS O111:B4),4小时后牺牲动物。取一段回肠,常规制备回肠石蜡切片,进行HE染色、免疫组织化学检测,或放入液氮冻存以备Western blot检测。3.放疗性肠损伤模型:卵巢去势小鼠每天8am分别给予0.1ml生理盐水或G-1腹腔注射28天,第29天6MV-X直线加速器对小鼠行全身放射照射(10GY)一次,连续三天每天早晨9am称重,3天后牺牲动物。取一段回肠,常规制备回肠石蜡切片,进行HE染色、免疫组织化学检测,或放入液氮冻存行Western blot检测。4.小肠类器官培养:小鼠安乐死后,迅速剖开腹腔,灌入冰冷PBS。距回盲部10cm处取一段15cm左右的回肠,纵向切开,用冷PBS彻底清洗小肠。用盖玻片或者手术刀刮下绒毛,冷PBS清洗。将小肠切成小片段,转移到50ml离心管中,加入PBS吹打后,弃上清,反复三次。加入30ml冰冷2mmol的EDTA/PBS在4℃震摇30min,100rpm离心,移除上清。加入冷PBS,吹打、静置后,经70μm细胞筛筛选至新的50ml离心管中,4℃离心300rcf 5min。去除上清液,收集隐窝细胞,接种于基质胶中,加入完全培养基置于细胞培养箱中培养。培养24小时后根据研究需要用不同药物处理(G-1:10-7M;Wnt3a:5ng/ml;IWP2:5μM),培养4-5天后收集细胞进行 EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)染色,QRT-PCR或 Western blot 检测。研究内容:1.在体实验:免疫荧光染色GPER及GFP(标记Lgr5+)检测GPER在回肠的表达和细胞定位;免疫荧光染色 Phosphorylation of extracellular signale regulated kinases1/2(p-ERK1/2)检测p-ERK1/2在回肠的表达和定位。HE染色检测回肠隐窝深度、绒毛长度;免疫组织化学Ki67和Brdu染色检测隐窝细胞增殖;免疫组织化学MUC-2染色及PAS(Periodic Acid-Schiff stain)糖原染色检测杯状细胞表达;免疫组织化学以溶菌酶(lysozyme,Lyz)标记计数潘氏细胞。Western blot检测回肠干细胞标记物Lgr5表达;细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinB1表达;潘氏细胞特异性产物溶菌酶、防御素α1(Defensin alpha1,Defa1)、Wnt3表达,;Wnt信号途径下游关键蛋白β-catenin、c-Myc表达;p-ERK1/2表达;炎性介质iNOS、COX2、TNF-α表达。QRT-PCR检测潘氏细胞成熟相关基因MMP7和SOX9 mRNA表达,Wnt下游靶基因β-catenin、c-Myc表达。2.类器官培养:观察记录类器官面积和出芽;EdU试剂盒检测细胞增殖;Westernblot检测潘氏细胞产物lyz、Defa1、Wnt3表达;Wnt信号途径关键蛋白β-catenin表达;干细胞标记物Lgr5表达。QRT-PCR检测潘氏细胞成熟相关基因MMP7和SOX9表达。研究结果:1.回肠Lgr5+干细胞和潘氏细胞均表达GPER。2.GPER激活对干细胞增殖的影响及机制2.1与注射生理盐水组相比,GPER选择性激动剂G-1处理4周,回肠隐窝深度增加;隐窝Ki67和Brdu阳性细胞数目增加;干细胞标记物Lgr5、细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinB1表达上调。G-1处理2周,回肠隐窝Ki67阳性细胞数目增加,Lgr5表达不变。离体培养隐窝类器官,G-1处理5天,类器官面积和出芽明显增多,EdU阳性细胞数目增加,Lgr5表达不变。2.2 G-1处理4周,回肠组织Wnt信号途径配体Wnt3表达增加;Wnt信号途径下游的靶基因β-catenin、c-Myc基因和蛋白水平均表达上调。G-1处理2周,Wnt3及Wnt信号途径靶基因β-catenin表达上调。离体培养隐窝类器官,G-1处理5天促进类器官Wnt3及Wnt下游的靶基因β-catenin表达。应用IWP2抑制离体类器官潘氏细胞Wnt3分泌后,虽然G-1处理依然上调Wnt3表达,但G-1促进类器官形成及上调Wnt下游靶基因β-catenin表达的作用被阻断。提示GPER激活促进干细胞增殖与潘氏细胞Wnt3合成分泌有关。3.GPER激活对潘氏细胞和杯状细胞的影响3.1 G-1处理4周,回肠溶菌酶阳性潘氏细胞数目减少,lyz、Defa1表达上调,MMP7和SOX9 mRNA表达上调,提示潘氏细胞成熟增加。离体培养的隐窝类器官,G-1处理5天未影响潘氏细胞lyz、Defa1表达,MMP7和SOX9 mRNA表达也未发生改变。3.2G-1处理2周,回肠PAS阳性杯状细胞数目未发生变化。G-1处理4周,PAS阳性杯状细胞、MUC-2阳性杯状细胞数目减少。3.3免疫荧光染色显示p-ERK表达在回肠隐窝底部干细胞区和暂时扩增(transit amplifying,TA)区。G-1处理2周,小鼠回肠p-ERK1/2水平不变。处理4周后,回肠p-ERK1/2水平增加。MEK抑制剂PD处理抑制ERK1/2磷酸化后,PAS 阳性杯状细胞数目增多;未影响Wnt3、lyz表达,溶菌酶阳性潘氏细胞数目也未发生改变。3.4G-1处理4周,小鼠结肠p-ERK1/2水平增加;PAS阳性杯状细胞数目减少,Wnt3表达不变。PD处理抑制ERK1/2磷酸化后,结肠PAS阳性杯状细胞数目增加,Wnt3表达不变。4.GPER激活对化疗性肠损伤模型干细胞损伤的保护作用放疗诱导的肠损伤模型,小鼠体重显著下降,回肠上皮损伤评分、隐窝损伤评分明显升高,Ki67阳性细胞数目减少。G-1预处理显著抑制放疗引起的小鼠体重下降,改善肠上皮和隐窝损伤情况,上调隐窝Ki67阳性细胞数目,提示GPER激活保护放疗引起的干细胞损伤。5.GPER激活在肠炎模型中的抗炎作用LPS诱导的急性肠炎模型,小鼠回肠水肿、粘膜上皮损伤明显,G-1预处理可以显著改善肠炎症状,炎症相关因子iNOS、COX2、Tnf-α表达均下调,潘氏细胞抗菌肽防御素α1表达上调,提示G-1处理减轻了 LPS诱导肠炎的炎症反应。结论1.GPER在回肠隐窝Lgr5+干细胞和潘氏细胞表达。2.潘氏细胞GPER激活,上调潘氏细胞Wnt3表达,通过旁分泌机制激活干细胞Wnt/catenin信号途径,促进干细胞自我更新和增殖,G-1预处理通过促进干细胞增殖对放疗性肠损伤模型发挥保护作用。3.潘氏细胞来源的Wnt3以自分泌机制促进潘氏细胞成熟,增加潘氏细胞抗菌肽分泌,G-1预处理通过促进潘氏细胞抗菌肽合成抑制LPS诱导的肠道炎症。4.干细胞GPER激活,抑制干细胞向杯状细胞分化,与GPER引起的ERK1/2激活有关。