研究目的:骨血管分布密集且广泛,在骨的生长发育中,骨血管不仅提供必需的氧和营养物质,而且通过调节各种骨细胞和血管细胞间的相互作用,为骨形成提供必要的刺激信号。局部血管的变化也与许多骨疾病的发展密切相关,如骨质疏松、骨坏死、骨关节炎、佝偻病、缺血性坏死、骨肿瘤的发生与转移等。骨血管与骨形成相伴发生,骨细胞可分泌促血管生成因子来触发信号引起不同细胞(包括形成血管的内皮细胞以及软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等)释放相关细胞因子进一步促进血管生成。与此同时,骨血管内皮细胞释放的因子对软骨细胞及成骨细胞也起到一定的作用。近年来有研究报道,肾连蛋白(nephronectin,NPNT)是由成骨细胞分泌的重要的血管生成因子,并且在调节骨代谢过程中也有着重要的作用。因此,本研究探究机械牵张成骨细胞对NPNT的调控作用,为进一步探究运动是否可以通过成骨细胞表达细胞因子调控骨微环境血管生成提供理论基础,也为骨质疏松等相关骨疾病的治疗提供新思路。研究方法:1.将培养的MC3T3-E1成骨细胞分为4组(C组,S1组,S2组和S3组),以1×10~5/ml接种到BioFlex 6孔板,细胞长至80%后使用Flexcell-5000细胞牵张仪对细胞进行牵张干预。其中S1组采用6%牵张幅度,0.5 Hz,时间为2h连续5天的干预方案;S2组采用6%牵张幅度,0.5 Hz,时间为4h连续5天的干预方案;S3组采用4%牵张幅度,0.5 Hz,时间为4h连续5天的干预方案。C组静置培养。每48h更换培养液。第5天机械牵张干预结束后收集细胞。采用Real-time PCR检测ALP,RUNX2,Osterix及NPNT mRNA的表达情况,并通过Western blot检测NPNT蛋白的表达。2.将传至第3代的C57BL/6小鼠原代成骨细胞以1×10~5/ml接种到BioFlex 6孔板,细胞长至80%后使用Flexcell-5000细胞牵张仪对细胞进行牵张干预。牵张组采用3%牵张幅度,0.5 Hz,干预时间为2h和4h的牵张方案对原代成骨细胞进行为期7天的牵张刺激,隔天机械牵张一次,即第1,3,5,7天干预,对照组静置培养。每48小时更换培养液。并收集培养液对SVEC细胞进行培养,采用划痕伤口愈合试验观察该培养液对SVEC细胞增殖、迁移的影响。第7天机械牵张干预结束后收集细胞。采用ALP染色检测成骨细胞ALP活性;Real-time PCR检测ALP,RUNX2,Osterix及NPNT mRNA的表达情况;Western blot及免疫组织化学染色检测NPNT蛋白的表达情况。研究结果:1.机械牵张MC3T3-E1成骨细胞对其分化及NPNT表达的影响(1)Real-time PCR结果显示:机械牵张应力可以促进MC3T3-E1成骨细胞ALP mRNA的表达,以4%牵张幅度4h连续5天干预的效果最佳(P<0.05);而在6%牵张幅度连续5天的机械牵张应力下显著下降(P<0.01);与对照组相比,RUNX2 mRNA在6%牵张幅度,2h和4%牵张幅度4h连续5天的机械牵张应力下表达均明显上调(P<0.05);而Osterix mRNA在4%牵张幅度4h连续5天的机械牵张应力下表达显著上调(P<0.01);同时,4%牵张幅度4h连续5天的机械牵张应力可显著促进NPNT mRNA的表达(P<0.01)。(2)Western blot结果显示,6%牵张幅度4h连续5天的机械牵张应力可使NPNT蛋白的表达上调(P<0.05)。2.机械牵张原代成骨细胞对其分化及NPNT表达的影响(1)Real-time PCR结果显示:3%牵张幅度2h连续7天隔天干预的机械牵张应力可使原代成骨细胞ALP mRNA和RUNX2 mRNA表达上调(P<0.05);3%牵张幅度4h连续7天隔天干预的机械牵张应力可使原代成骨细胞ALP mRNA和RUNX2 mRNA表达上调(P<0.01);而Osterix mRNA及NPNT mRNA的表达只在3%牵张幅度4h连续7天隔天干预的机械牵张应力刺激下显著上调(P<0.01)。(2)ALP染色结果显示,3%牵张幅度4h连续7天隔天干预的机械牵张应力可促进成骨细胞ALP的分泌。(3)Western blot结果显示,3%牵张幅度4h连续7天隔天干预的机械牵张应力可提高原代成骨细胞NPNT蛋白的表达,但没有显著性差异。(4)免疫组织化学染色显示,3%牵张幅度4h连续7天隔天干预的机械牵张应力可促进成骨细胞NPNT的分泌。(5)划痕伤口愈合试验显示机械牵张成骨细胞可促进SVEC细胞增殖与迁移。研究结论:机械牵张应力可促进成骨细胞分化,并使NPNT的表达上调;机械牵张成骨细胞可促进SVEC细胞增殖与迁移,可能是机械牵张成骨细胞促进了NPNT的表达,而NPNT作为一种促血管生成因子,促进了SVEC细胞的增殖及迁移,但具体机制还需进一步验证。