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目的: 1.利用小干扰 RNA(siRNA)沉默耐吉非替尼 A549(A549/GR)细胞的胰岛素生长因子1受体(IGF-1R)基因,为进一步探讨IGF-1R信号通路的激活对肺腺癌表皮生长因子受体抑制剂(EGFR-TKIs)的耐药性研究提供细胞模型; 2.探讨IGF-1R旁路相关微小RNA(miRNA)与EGFR-TKIs耐药的关系。 方法: 1. A549/GR由前期实验获得,复苏A549/GR细胞,CCK-8法测定A549/GR对A549的耐药倍数; 2.设计并化学合成针对IGF-1R基因编码区的siRNA3对,并以1对无关序列的寡核苷酸作为阴性对照。将化学合成siRNA用脂质体介导法转染至A549/GR细胞,实验分为6组:siRNA-1组、siRNA-2组siRNA-3组、阴性对照组、阳性对照组、空白对照组。转染后48h应用Real-time PCR方法检测IGF-1R siRNA转染的基因干扰效率; 3.miRNA芯片检测A549/GR与IGF-1R-siRNA-A549/GR中miRNA的表达差异。 4.RT-PCR验证miRNA芯片结果。 结果: 1. CCK-8法测得A549/GR细胞的耐药指数为亲代细胞的6.00倍;A549/GR细胞倍增时间较A549细胞缩短(31.97h VS.34.85 h,p<0.01); 2.成功构建了 IGF-1R基因表达沉默的 A549/GR细胞株模型,RT—PCR结果显示siRNA实验组与空白对照组相比IGF-1R mRNA的的表达水平均明显降低,差异有统计学意义,其中siRNA-2组的沉默效率最高,为72%; 3.通过对A549/GR与IGF-1R-siRNA-A549/GR中miRNA表达谱进行数据分析,P<0.05的miRNAs有72条,其中在IGF-1R-siRNA-A549/GR中上调的有13条,包括miR-497-3p、miR-1273c等;下调的有59条,包括miR-361-3p、miR-345-3p等; 4.将miRNA芯片中差异表达较显著且信号值较高的10条miRNAs进一步采用RT-PCR验证,其中10条均与芯片结果一致。 结论: 1.成功建立了IGF-1R基因表达沉默的人肺腺癌A549/GR细胞株模型。 2. miRNA芯片是筛选差异表达miRNA的有效工具。 3.IGF-1R沉默组与对照组miRNA表达差异显著,IGF-1R旁路相关miRNA在EGFR-TKIs继发性耐药中发挥了重要作用。 4.miR497、miR-144的异常表达参与了 IGF-1R旁路激活途径,是EGFR-TKIs耐药的重要分子机制之一。