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近年来,世界范围内不孕不育的发病率呈逐年上升趋势,大约10%-15%的育龄期夫妇会受到不孕症的困扰。在我国,育龄夫妇不孕不育的患病率约为25%。随着工业化的发展,在影响不孕不育的众多因素中,环境污染被认为是导致不孕不育的重要危险因素之一,环境污染物已对人类健康构成了威胁。邻苯二甲酸酯(phthalates esters,PAEs)作为典型的环境内分泌干扰物,广泛应用于塑料制品的生产。邻苯二甲酸二乙基己酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是PAEs中最常用的一种,其作为增塑剂广泛应用于个人护理产品、日化用品、食品包装、医疗器械等的生产中。目前,DEHP可在全球范围内的大气、土壤、水域及动植物体内检出,被称之为“无处不在的污染物”。流行病学研究表明:DEHP暴露与肥胖、乳腺癌、行为障碍等多种疾病的发生有密切相关性,其中包括女性生殖功能损伤。在寻求辅助生殖助孕的女性中开展的研究表明,DEHP日常暴露即可导致卵巢储备下降、获卵率降低、卵母细胞质量下降、临床妊娠率以及活产率下降、早期流产率升高等问题,从而引起女性生育力下降或导致不孕。动物研究表明:DEHP暴露通过影响激素合成分泌、原始卵泡和生长卵泡的发育以及卵子成熟等卵巢功能引起生殖毒性。日益严重的DEHP污染对女性生殖健康构成严重威胁,引起的女性生育力下降已成为世界范围内不可忽视的问题。然而,目前关于DEHP对雌性生殖毒性方面的研究仍较少,且毒性特点及作用机制尚不完全明确。近年来辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)成为不孕不育人群的主要助孕手段。子宫内膜容受性和胚胎质量是ART成功的关键因素,其中卵母细胞的质量与胚胎的质量息息相关。本研究以DEHP对卵母细胞质量的影响为切入点,主要探讨DEHP对卵母细胞发育潜能的影响,并对其作用机制进行初步探索,以期为DEHP导致的生殖损伤的防治提供一定的理论依据。目的本研究的目的在于通过对雌性小鼠灌胃染毒DEHP,构建DEHP不同暴露水平的动物模型,观察其对卵母细胞发育潜能的影响及其机制初探。资料与方法研究对象:本实验选取清洁级3周龄昆明雌性小鼠及7～10周龄昆明雄性小鼠,将雌鼠随机分为4组,分别为对照(玉米油)组和DEHP低、中、高剂量染毒组(300mg/kg、600mg/kg、1200mg/kg),每组 20 只,构建 DEHP 暴露模型。染毒方法采用经口灌胃方式进行,染毒容量为5ml/kg,1次/天,5天/周,连续6周。研究方法:造模结束后,将部分雌鼠用PMSG促排后与雄鼠合笼,次日取受精卵,体外培养观察卵裂率及囊胚形成率;部分雌鼠与雄鼠自然合笼后观察子宫内胚胎着床位点数;部分雌鼠用PMSG促排后取卵母细胞,用Ca2+荧光探针(Fluo-4 AM)、活性氧(ROS)检测试剂盒检测各组卵母细胞内Ca2+、ROS水平;并用Ca2+荧光探针(Fluo-4AM)、ROS检测试剂盒、线粒体绿色荧光探针Mito-Tracker Green、JC-10荧光探针、qRT-PCR分别检测囊胚中Ca2+、ROS水平、线粒体分布、膜电位、线粒体DNA拷贝数;比较DEHP暴露组与对照组之间的差异。统计学方法:实验数据采用SPSS 22.0软件进行分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,计数资料采用率(%)表示。多组间计量资料比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验;计数资料采用χ2检验或Fisher’s exact检验。以P<0.05为有统计学差异。结果(1)DEHP对雌性小鼠体重变化的影响:各组小鼠的体重变化总体没有统计学差异(P=0.067)。(2)DEHP对早期胚胎发育的影响:各组胚胎卵裂率、囊胚形成率的比较一DEHP低、中、高剂量组小鼠胚胎的卵裂率(69.09%、70.95%、60.47%)均低于对照组(87.12%),差异有统计学意义(P=0.000;P=0.000;P=0.000),DEHP低、中、高剂量组之间相比无统计学差异(P>0.05);DEHP低、中、高剂量组小鼠胚胎的囊胚形成率(64.04%、49.52%、32.69%)均低于对照组(86.62%),差异有统计学意义(P=0.000;P=0.000;P=0.000),且随着染毒剂量的升高,囊胚形成率显著下降,DEHP低、中、高剂量组之间相比,差异也有统计学意义(DEHP低vs中P=0.030;DEHP 低 vs 高P=0.000;DEHP 中 vs 高P=0.046)。(3)DEHP对胚胎着床位点数的影响:DEHP低、中、高剂量组雌鼠子宫内胚胎着床位点数[(13.80±1.92)、(13.80±1.79)、(13.20±2.05)]均低于对照组(16.80±0.84),差异有统计学意义(P=0.014;P=0.014;P=0.004),而DEHP暴露组之间相比无统计学差异(P>0.05)。(4)DEHP对卵母细胞内ROS、Ca2+浓度的影响:ROS检测结果显示:卵母细胞内ROS水平随着染毒剂量的升高而逐渐升高;DEHP中、高剂量组小鼠卵母细胞内ROS水平[(0.051 ±0.032)、(0.066±0.021)]显著高于对照组(0.026±0.011),差异有统计学意义(P=0.000;P=0.000),DEHP低剂量组小鼠卵母细胞内ROS水平(0.028±0.012)较对照组升高不明显,差异无统计学意义(P>0.05,P=0.701)。Ca2+浓度检测结果显示:卵母细胞内Ca2+水平随染毒剂量的升高而逐渐升高;DEHP中、高剂量组小鼠卵母细胞内Ca2+水平[(0.150±0.024)、(0.172±0.001)]显著高于对照组(0.051±0.039),差异有统计学意义(P=0.000;P=0.000),DEHP低剂量组小鼠卵母细胞内Ca2+水平(0.069±0.015)较对照组升高不明显,差异无统计学意义(P>0.05,P=0.104)。(5)DEHP对囊胚线粒体功能的影响:囊胚内ROS浓度检测结果:胚胎内ROS水平随着染毒剂量的升高而逐渐升高;DEHP中、高剂量组小鼠胚胎内ROS水平[(0.040±0.005)、(0.047±0.007)]显著高于对照组(0.028±0.001),差异有统计学意义(P=0.009;P=0.000);DEHP低剂量组小鼠胚胎内ROS水平(0.031±0.003)较对照组升高不明显,差异无统计学意义(P>0.05,P=0.465)。囊胚内Ca2+浓度检测结果:胚胎内Ca2+水平随着染毒剂量的升高而逐渐升高;DEHP低、中、高剂量组小鼠胚胎内Ca2+水平[(0.091±0.031)、(0.162±0.016)、(0.170±0.004)]均高于对照组(0.056±0.035),差异有统计学意义(P=0.013;P=0.000;P=0.000);DEHP中、高剂量组与低剂量组相比,差异有统计学意义(P=0.000;P=0.000)。囊胚线粒体分布检测结果:随着染毒剂量的升高,胚胎内线粒体的分布越来越不均匀。囊胚线粒体膜电位检测结果:随DEHP暴露剂量的升高,线粒体膜电位逐渐降低;DEHP低、中、高剂量组小鼠囊胚的线粒体膜电位[(2.10±1.22)、(0.78±0.35)、(0.36±0.14)]均显著低于对照组(10.02±4.97),差异有统计学意义(P=0.000;P=0.000;P=0.000),DEHP暴露组之间比较差异无统计学意义(DEHP低vs 中P=0.446;DEHP低vs 高P=0.299;DEHP 中 vs 高P=0.802)。囊胚线粒体DNA拷贝数检测结果:随染毒剂量的增加,线粒体DNA拷贝数有升高趋势,以DEHP中剂量组线粒体DNA拷贝数(22018.53±8442.04)明显高于对照、低、高剂量组[(11358.56±1627.23)、(11155.68±1985.93)、(13127.30±2699.46)],差异有统计学意义(P=0.000;P=0.000;P=0.001),DEHP高剂量组拷贝数高于对照组,但差异无统计学意义(P=0.505)。结论(1)DEHP暴露会降低小鼠体外培养胚胎的卵裂率、囊胚形成率,并且会降低胚胎着床位点数。(2)DEHP暴露会导致小鼠卵母细胞及胚胎线粒体功能受损,影响胚胎质量。