拟南芥子叶表皮细胞(cotyledon pavement cell,PC)是一种具有特殊形态的细胞,类似于七巧板形状,呈现相互交错的嵌合状态。据报道,子叶表皮细胞的嵌合状态是通过调控细胞的各向异性生长而形成,受ROP小G蛋白(Rho-related GTPase of plants)的调控,主要是ROP2和ROP6蛋白的作用。另有报道发现两种蛋白:ECH(ECHIDNA)和YIP(YPT/RAB GTPase Interacting Protein)彼此之间具有互作,在拟南芥中形成一种定位于反面高尔基网(transgolgi network,TGN)的复合物,调控细胞壁合成成分的运输过程。ROP蛋白和ECH/YIP二者能够影响拟南芥细胞伸长,改变细胞的形状,因此,本研究猜想ECH/YIP与ROP在某方面可能存在联系。然而,关于ECH和YIP如何通过影响ROP而进一步调控子叶表皮细胞形态建成的机制尚不清楚。本项研究中,选用拟南芥子叶作为材料,研究了ECH和YIP与ROP2/ROP6的关系、与细胞骨架的关系。首先本研究通过杂交得到ech/GFP-ROP2,yip4a yip4b/GFP-ROP2,ech/GFP-ROP6,yip4a yip4b/GFP-ROP6株系,杂交株系的表型均趋向于ech和yip4a yip4b,植株变矮、多分支,子叶变得细尖。在ECH和YIP蛋白缺失时,研究发现,不管是细胞质内还是细胞膜上,ROP2和ROP6的表达均受影响。为进一步证明这个结论,本研究在转录水平上证实了ROP2和ROP6的mRNA表达会降低,说明ECH和YIP可能直接或间接调控ROP2和ROP6基因的表达。同时,在蛋白水平上,本研究检测了ROP2和ROP6总蛋白的表达情况,发现除了ROP2蛋白在ech中升高之外,ROP6在ech、ROP2与ROP6在yip4a yip4b中总蛋白的表达均降低。接着,为了研究ROP活性与ECH和YIP的联系,通过Pull-down实验发现ROP2蛋白在突变体中活性降低,说明ECH和YIP可能是ROP2的上游效应因子,能够激活ROP2;而ROP6在yip4a yip4b中活性降低,在ech中活性却升高。这说明了PC中ROP的激活过程需要ECH和YIP参与。由于ROP能够调控细胞骨架,进一步从细胞骨架角度研究,发现ech和yip4a yip4b中微管变得整齐,微丝变得纤细且整齐,细胞骨架的混乱程度减弱。另外,本研究通过构建ECH、YIP4a和YIP4b过表达载体和瞬时表达实验,初步发现ECH/YIP基因在子叶中呈点状定位,证明了ECH和YIP定位于反面高尔基体网上。在ECH、YIP4a和YIP4b组织表达模式方面,本研究使用GUS染液追踪了子叶发育的不同阶段中ECH和YIP的表达位置和表达量。这为研究ECH和YIP在子叶表皮细胞形态建成的调控作用奠定了基础。综上所述,本研究以ECH和YIP调控细胞伸长为启发点,以ROP能够调控细胞的形态建成、影响子叶表皮细胞的嵌合状态为出发点,阐明了ECH和YIP的存在能够影响ROP的表达和蛋白活性,进而改变拟南芥子叶表皮细胞的嵌合状态。通过进一步分析对细胞骨架的影响,本研究发现了ECH和YIP影响微管和微丝的重排,最终证明了ECH和YIP参与细胞的形态建成。本次研究为进一步探索ECH和YIP在子叶表皮细胞形态建成中的调控通路提供了一个新的研究进展。